6流式細(xì)胞術(shù)的質(zhì)量控制和影響因素(參考版)
2025-03-10 21:02本頁(yè)面
【正文】 3設(shè)對(duì)照樣品，與抗體來(lái)源的同型對(duì)照和熒光抗體的本底對(duì)照 對(duì)于需要保存不能馬上進(jìn)行定量分析的標(biāo)本，在免疫熒光染色后，不固定可以在 4℃ 放置 48小時(shí)不出現(xiàn)熒光強(qiáng)度或標(biāo)記陽(yáng)性率降低。 解決這些影響因素的方法： 1 使動(dòng)物血清蛋白等封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，熒光抗體染色后充分洗滌。 ③細(xì)胞重疊和凝集團(tuán)塊。 八、流式免疫學(xué)檢測(cè)的質(zhì)量控制 在免疫熒光染色過程中常出現(xiàn)一些人為非特異性熒光，造成本底熒光過高，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，常見的原因有： ①降低抗體非特異性結(jié)合的措施不夠。 假性異倍體出現(xiàn)的原因主要有組織自溶造成或在組織固定前或期間，細(xì)胞DNA出現(xiàn)變性 (而非降解階段 )，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變性，與熒光染料結(jié)合增加或減少，更多出現(xiàn)在異倍體細(xì)胞數(shù)僅占總測(cè)細(xì)胞數(shù)的 510%的情況下 對(duì)于二倍體為主峰的右側(cè)出現(xiàn)的異倍體峰，用 %胃蛋白酶或 1%的 DNA酶消化 35分鐘，如果再測(cè)仍然出現(xiàn)異倍體峰可為真性異倍體，如果異倍體峰消失，則認(rèn)為是假性異倍體。 ◆ 在不具備同個(gè)體，同源組織的情況下，可以使用雞紅細(xì)胞，或其他生物細(xì)胞為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，作為計(jì)算倍體的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞，但這種標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞的使用，僅限于新鮮組織倍體的判定，對(duì)于石蠟包埋組織倍體標(biāo)準(zhǔn)，解決的辦法是將正常組織與腫瘤組織同時(shí)包埋于一個(gè)石蠟組織塊中，這樣正常組織作為一個(gè)二倍體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn) ,能減少 DNA倍體分析的誤差。 ◆同樣的儀器檢測(cè)條件。 ◆相同的樣品處理方法。對(duì)于這樣峰位，除了可用計(jì)算機(jī)軟件加以消除外，可放棄 S期的計(jì)算 DNA倍體標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制： DNA倍體的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)正常二倍體細(xì)胞DNA含量的分布范圍而確定的，對(duì)于二倍體的標(biāo)準(zhǔn)的選擇，應(yīng)遵照如下原則： ◆采用同個(gè)體同源正常組織。大量報(bào)道認(rèn)為， S期有明顯的臨床預(yù)后意義，但 S期計(jì)算方面容易產(chǎn)生誤差 ,而造成評(píng)價(jià) S期在腫瘤生物學(xué)行為不確切性 對(duì)于 S期細(xì)胞計(jì)算較準(zhǔn)確的方法，就是分別作兩次樣品的檢測(cè)，加入 DNA倍體標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)一次，不加二倍體標(biāo)準(zhǔn)的樣品檢測(cè)一次， G0/1峰應(yīng)是一個(gè)正態(tài)分布(或稱高斯分布 )。如果單獨(dú)作DNA倍體分析而不作細(xì)胞周期的處理，小于 1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞也可以，但異倍體細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的 10%以下時(shí)，不可盲目下結(jié)論，至少異倍體細(xì)胞占總細(xì)胞的 20%以上，可以確定異倍體的存在 正常二倍體細(xì)胞組方圖的 CV值大于8%以上，應(yīng)放棄細(xì)胞周期的分析，但腫瘤細(xì)胞 CV值大于 8%，這與腫瘤細(xì)胞DNA異質(zhì)性增大有關(guān)。因此在熒光測(cè)定時(shí)要保持染色后的樣品在適當(dāng)?shù)蜏丨h(huán)境下運(yùn)行，盡可能減少樣品的照射時(shí)間，有條件時(shí)應(yīng)使樣品觀察室做到恒溫裝置，會(huì)得到更好的熒光定量結(jié)果 接比例關(guān)系： 在溶液較稀時(shí)，熒光強(qiáng)度與濃度成正比關(guān)系，隨濃度加大，熒光強(qiáng)度也增大，當(dāng)熒光染料達(dá)到一定濃度時(shí)，如繼續(xù)增加濃度不僅不會(huì)使熒光強(qiáng)度有相應(yīng)的增加，反而使熒光強(qiáng)度減低，這種因染料濃度增大使熒光量子的產(chǎn)額下降的現(xiàn)象稱為濃度猝滅
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