流式細胞術在哺乳動物精液質量檢測中的應用-在線瀏覽
2024-08-17 15:11本頁面
【正文】 ately evaluate semen quality.Key words: Flow cytometry。 Evaluation。常規(guī)的精液檢查（精子密度、活力、形態(tài)等）重復性差，提供的精子功能的信息非常有限，不能為生育力提供準確評估的依據。近年來，隨著生殖生物學的發(fā)展和人類對輔助生殖技術的迫切需求，基于精子形態(tài)學觀察為主的傳統(tǒng)檢測方法已不能滿足人們的需要，因而尋找一種快速、準確的精液質量檢測方法顯得十分迫切。流式細胞術的基本原理是：特異熒光探針標記的單細胞懸液在管道中穩(wěn)定地流動，細胞一個個依次經過噴嘴，經恒定功率的激光束激發(fā)后產生散射光和激發(fā)熒光。在此基礎上還可以根據有關參數把所需細胞亞群從整個樣品中分選出來。流式細胞儀為精子功能實驗提供了快速、客觀、多指標、大通量的檢測手段，彌補了傳統(tǒng)方法的缺陷，成為一種檢測精液質量的新平臺。本文就流式細胞儀近年來在檢測精子的質膜完整性、頂體狀態(tài)、染色質結構完整性、線粒體功能、細胞凋亡等方面的應用作一簡要綜述，并對其應用前景作一展望。對死精子特異的熒光染料有碘化丙錠(propidium iodide，PI)、Hoechst 3325溴化乙錠(ethidium bromide,EB)、溴乙啡錠二聚體（ethidium homodimer1,EthD1）和YoPro1等，其中PI最為常用。對活精子特異的熒光染料有SYBR1羧基熒光素雙醋酸鹽(carboxyfluorescein diacetate,CFDA)、羧基二甲基熒光素雙醋酸鹽（carboxy dimethyl fluorescein diacetate,CMFDA）、CarboxySNARF1和SYTO17等。其中，CarboxySNARF1是一種胞內pH指示劑，在活精子內發(fā)橙紅色熒光(Pena et al，1999)；SYTO17標記活精子的細胞核，發(fā)紅色熒光(Thomas et al,1997)；CFDA和CMFDA是一種非熒光化合物，在活細胞胞內被非特異酯酶水解，形成一種很強的熒光染料，發(fā)綠色熒光(Pena et al,1998。這兩類染料經常聯合使用。SYBR14和PI聯合使用，可以很好地檢測精子活力（Garner et al，1994；Garner amp。其原理可能是PI進入死精子頭部后端，取代了SYBR14或使SYBR14的熒光猝滅。這種方法已用于檢測許多物種的精子活力。CarboxySNARF1也可以和PI聯合使用，CarboxySNARF1發(fā)橙紅色熒光,但其熒光值大大低于PI的熒光值，用同一個探測器也能把兩者區(qū)別開(Pena et al,1999)。否則只用PI測活力，活精子和顆粒較大的雜質（如蛋黃顆粒）都不能被PI標記，也就不能把兩者區(qū)分開。本研究室發(fā)展了一種僅用紫外激光就同時激發(fā)這兩種探針來檢測精子活力的方法：活精子只被Hoechst 33342標記，發(fā)藍色熒光；死精子為PI陽性，同時也被Hoechst 33342標記，故死精子為粉紅色。該方法已成功地用于牛、獼猴、食蟹猴、人、大鼠、小鼠精子活力的檢測（資料待發(fā)表）。該組合染色時間短，對溫度要求不嚴格，且都是核染料。2 檢測頂體狀態(tài)在受精過程中，哺乳動物剛射出的精子在體內要經過獲能和頂體反應，才能穿入卵細胞并與其融合，完成受精。金霉素(chlortetracycline,CTC)頂體染色法,是熒光顯微鏡檢測的常用方法，可客觀而定量地評價精子獲能、頂體反應(DasGupta et al,1993)。精子在獲能和頂體反應過程中，精子膜外源凝集素受體會發(fā)生變化。已經有多種凝集素被用于精子頂體狀態(tài)檢測，如花生凝集素（PNA）、豌豆凝集素（PSA）、刀豆凝集素（ConA）和植物血凝素（RCA）等。經電子顯微鏡觀察證實，PNA特異結合頂體外膜（Szasz et al,2000）。頂體完整的精子可結合更多的FITCPNA，故FITCPNA熒光值變得更高；而頂體反應后，頂體丟失，FITCPNA的熒光值又較低(Purvis et al,1990)。因而檢測頂體反應必須同時檢測精子的活力。盡管這種方法可以同時測得精子活力和頂體狀態(tài)，但該方法較煩瑣。其結果PI+為死精子；PI－/PNA+為頂體反應精子；PI－/PNA－為頂體完整的活精子(Graham et al,1990；Szasz et al,2000)。此外，熒光素標記的頂體特異性單克隆抗體結合Hoechst 33258的雙標記也能檢測頂體反應(Tao et al,1993b)。經證明，LysoTracker陽性率與顯微鏡觀察到的正常頂體的百分率相吻合（Thomas et al,1997）。質膜不穩(wěn)定性加劇也是精子獲能的另一種表現形式，因而也可用疏水性染料與膜不透性探針反映精子獲能。常用部花青540（merocyanine 54，發(fā)射光峰值為570～590nm）與YoPro1（發(fā)射光峰值509nm）雙標記，可檢測到死精子、未獲能活精子和獲能活精子(Harrison et al,1996)。精子核高度致密，其DNA與魚精蛋白緊密結合，這樣可以將父方遺傳信息準確無誤地導入卵，繼而傳給后代。Pasteur et al (1991；1994)在研究人鮮精和凍精的PI染色特性時發(fā)現，DNA直方圖上有一主峰，該主峰右側還延伸出一小峰，小峰代表的是核凝聚度降低的精子，其染色質結構不穩(wěn)定，可染性增強；凍精的主峰及小峰熒光值顯著高于鮮精，說明冷凍使精子染色質凝聚度降低，DNA可染性增強。 Pan，1998）。廣為使用的權威方法是精子染色質結構檢測（sperm chromatin structure assay，SCSA）。因而利用染色質異常的精子易受熱或酸變性
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