流式細(xì)胞術(shù)在哺乳動物精液質(zhì)量檢測中的應(yīng)用-閱讀頁
2025-07-22 15:11本頁面
【正文】 成單鏈DNA，與染料吖啶橙結(jié)合發(fā)紅色熒光；而染色質(zhì)正常的精子能保持完整DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，與吖啶橙結(jié)合發(fā)綠色熒光這一特性，樣品經(jīng)熱或酸變性處理后，若紅光值比例增高，則說明染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常增加。SCSA主要用于以下方面。30％可作為評估精子的生育力高低的域值，大于該值的實(shí)驗組無妊娠成功者。）％與（177。27％，妊娠不能成功。Zini et al （1999；2000）發(fā)現(xiàn)，Percoll密度梯度離心處理后，不育組精液DNA變性率（COMPαt）明顯升高，正常組無顯著變化；而上游法可明顯改善回收精子的DNA完整性。這要求重新檢查目前常用的精液體外處理技術(shù)，避免造成對精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性的破壞。術(shù)前染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常的睪丸癌患者，比異常者更易恢復(fù)精子發(fā)生（Fossa et al,1997）。Bonde et al(2002)對帶鉛環(huán)境下作業(yè)的工人檢測發(fā)現(xiàn)，血液中鉛濃度高者，精子DNA更易變性。4 檢測精子的線粒體功能線粒體的主要功能是產(chǎn)生能量，為精子運(yùn)動提供ATP。R123是一種能滲透入細(xì)胞，帶陽離子的熒光探針，發(fā)綠色熒光。MITO是一種新型線粒體探針，在水溶液中并不發(fā)熒光，而當(dāng)積聚在線粒體內(nèi)，不論其膜電位如何皆發(fā)綠色熒光。Garner et al（1997）對3種染料作了比較研究，發(fā)現(xiàn)三者都與鏡檢活動精子百分率高度相關(guān)。目前認(rèn)為JC1是檢測精子線粒體功能最適合的探針。在牛、馬的精子檢測中也得到相似的結(jié)果(Garner et al,2001；Gravance et al，2000)。Evenson et al(1982)用Rhodamine 123和EB染色，同時檢測人精子活力和線粒體功能。Auger et al（1993）用R123與PI雙重染色，流式檢測結(jié)果為：死精子為PI陽性、R123陰性；有線粒體功能的活精子為PI陰性、R123陽性；已無線粒體功能的活精子為PI、R123雙陰性；PI、R123雙陽性的精子不記數(shù)。但該方法有一缺陷，JC1的J聚體發(fā)出的橙色熒光，會與PI的紅色熒光部分重疊(Garner amp。因此，還需要探索新的染色方法，更準(zhǔn)確地檢測精子的線粒體功能。但研究人員已經(jīng)采用檢測體細(xì)胞凋亡的方法來檢測精子的質(zhì)量。常用的方法是Annexin V /PI雙染法和末端標(biāo)記法（TUNEL）。凋亡細(xì)胞為Annexin V陽性、PI陰性。凋亡細(xì)胞為FITC陽性。Glander et al(1999)的結(jié)果表明，Annexin V /PI聯(lián)染法可很好的用于精子質(zhì)量檢測。Oosterhuis et al(2000)用Annexin V /PI聯(lián)染法和TUNEL法檢測了人新鮮精液的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)兩種方法檢測到的凋亡率均為20%左右，無顯著性差異；Annexin V陰性率與精子濃度和活動率，以及dUTP陽性率與精子濃度，都呈高度負(fù)相關(guān)。新鮮精液中凋亡精子的出現(xiàn)可能是其低生殖力的原因之一。前者能在分子水平靈敏地檢測精子細(xì)胞膜的變化，因而是更準(zhǔn)確可靠的指標(biāo)。Muratori et al（2000）也報道精子DNA的片斷化與精子前向運(yùn)動率呈負(fù)相關(guān)，與精子畸形呈正相關(guān)；但電鏡觀察并未發(fā)現(xiàn)DNA片斷化的精子出現(xiàn)凋亡相似的形態(tài)學(xué)變化，即出現(xiàn)凋亡小體。無論如何，這兩種方法都適合檢測精子的質(zhì)量。6 測量精子濃度及其他精子濃度是精液的一個基本指標(biāo)。由于至今還未發(fā)現(xiàn)精子表面的特異標(biāo)志，故不能像淋巴細(xì)胞那樣進(jìn)行流式絕對計數(shù)。在此基礎(chǔ)上，Eustache et al(2001)利用精子的散射光特性反映精子的大小和顆粒度，以及DNA的PI染色，經(jīng)過兩次設(shè)門，可以準(zhǔn)確地計算人精子的濃度。此外，F(xiàn)CM也用于檢測精液中的淋巴細(xì)胞和抗精子抗體，精子脂質(zhì)過氧化以及表面分子的表達(dá)，還可進(jìn)行精子泛素標(biāo)記免疫檢測等。雖然常規(guī)檢測方法很重要，但其在預(yù)測精子生育力方面的缺點(diǎn)顯而易見。只能同時檢測多個指標(biāo)，才能更好地反映精子的生育力。由于對精子運(yùn)動性檢查的變異性較大，若不直接測定精子運(yùn)動參數(shù)，而用FCM客觀地檢測精子的質(zhì)膜完整性、頂體狀態(tài)以及線粒體膜電位的變化，即可得知精子功能的情況。隨著新的熒光探針的不斷開發(fā)，染色方法的改進(jìn)，試劑盒的廣泛使用以及激光技術(shù)、電腦技術(shù)的迅速發(fā)展，F(xiàn)CM將更加方便快捷，并可進(jìn)行多種染料聯(lián)合使用，進(jìn)行多色分析，同時檢測多個指標(biāo)，準(zhǔn)確反映精子的功能。試驗主要在人，家畜（牛、羊、馬、豬、狗、兔）及實(shí)驗動物（大鼠、小鼠）中進(jìn)行，在野生動物方面還未見報道。FCM要作為常規(guī)檢測手段，解釋須慎重，需要同熒光顯微鏡結(jié)合使用，與傳統(tǒng)方法相互驗證，積累更多更可靠的數(shù)據(jù)，最終確證各方法的可靠性和權(quán)威性，并使各方法標(biāo)準(zhǔn)化。 圖3：SNARF/PI/FITCPSA 三標(biāo)記。可檢測出三群：熒光死的過渡狀態(tài)。 圖6 Merocyanin/Yopro雙標(biāo)記檢測精子獲能?？? C為誘導(dǎo)獲能的檢測結(jié)果。 圖4： Hoechst 33342/PI雙標(biāo)記測精子活力。分為三群：Hoechst 33342高染為活精子；PI陽性為死精子； PI陽性為死精子；Jaggregates為線立體功能高中間為過度狀態(tài)。 圖7：SCSA檢測精子染色質(zhì)完整性。A為利用散射光B，D為不育組精子。PI陽性為死精子；Annexin V +/PI –為凋亡精子； Annexin V– /PI –為活精子。A為陰性對照，未表記；B為陽性對照，Dnase 消化； C劃線區(qū)域為凋
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