【正文】 如果用酵母作為宿主上述許多。如果加工有困難，可以用合成基因，從而免除加工過程。合成的基因應含起始密碼ATG、通過該激素蛋白的氨基酸序列推測而來的編碼序列，以及1—2個終止密碼： ATG——————編碼序列——————TGA TAG 現在，這個合成基因可被插入載體中。這種DNA不含內含子可插入到載體中進行克隆。 針對上述可能出現的問題，建議在克隆的過程中采取以下措施： ①應將激素的編碼序列置于含有核糖體結合位點和起始密碼子ATG的細菌強啟動子的附近(含有這種序列的載體稱表達載體)。 (3)有些真核生物的蛋白質是通過前體分于加工而來的，例如胰島素就是通過加工去除 前體分子內部的33個氨基酸殘基而來，剩下的兩段肽鏈分別形成胰島素的a、b鏈。 (2)大多數真核基因有內含子，這些內含子在轉錄后從前體mRNA中被切除而形成成熟mRNA。另外設計一對引物，能夠在C端加上6個組氨酸和一個終止密碼。 圖22．9是編碼該蛋白的核苷酸序列。這些帶有組氨酸標簽的蛋白質能夠緊緊地同Ni2+柱結合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脫。4. 打算在細菌中表達一種稀有的人類某種蛋白質，以便能夠大量制備這種蛋白。從實驗平板上挑出12個菌落，分離了質粒DNA，并用BamHI進行切割，其中9個克隆產生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個克隆中切出一個cDNA片段，實驗終于獲得成功。在第二次實驗中，自己制備感受態(tài)細胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長(表22．2)。 實驗中同時設置了4個對照： 對照1： 將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上； 對照2： 將未切割載體轉化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上； 對照3： 將經切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用連接酶連接(但沒有cDNA片段)的 載體轉化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)乎板上； 對照4： 將經切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用DNA連接酶連接(但沒有cDNA片 段)的載體轉化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)子板上。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。 這個cDNA的兩側具有BamHI的位點，因此計劃將它從BamH[的位點插入載體中。 BamH I切割載體DNA 5’GATCG——————————————————G3‘ 3’C——————————————————CCTAG5‘ Kpn I 切割的片斷 5’C——————GGTAC3’ 3’CATGG——————C5’ 寡聚拼接片斷 ——————3’G5’GATCGATC3’C5’—————— —————— C CTAGCATG G————————圖22．7 用一種寡聚核苷酸片段連接不互補的限制性末端的圖解 (1)畫出KpnIBamHⅡ結合體和所需要的寡聚核苷酸片段的圖，這種寡聚核苷酸與圖22．7所示的是否相同? (2)畫出用連接酶處理過的分子圖，指明被連接的缺口。雖然寡聚核苷酸分子被限制性內切核酸酶切割后會產生合適的末端，但是，合成的寡聚核苷酸的末端都是羥基。一位朋友建議用圖22．7所示的寡聚核苷酸“片段”來進行連接。2．你打算將一個具有KpnI末端的DNA片段克隆到具有BamHI末端的載體中。 (4)烘干濾膜后進行放射自顯影后，所需的克隆就以一個黑點在膠片上顯示出來，這就是菌落或原位雜交分析。探針可以是來自另一不同生物體的相關的基因，或是依據與基因特異相關蛋白質的氨基酸序列設計并經化學合成的一小段DNA分子(圖A21．1．2)。一個常用方法是雜交(圖A21．1)： (1)從不同的克隆提取DNA，固定于硝酸纖維素濾膜上，然后用NaOH使之變性(圖 A21．)。33．答：帶有某一細菌基因的克隆通?？梢灾苯涌闯鰜?，因為基因表達引起了宿主細胞表型的可見變化。 (2)雖然RNA電泳前不需像DNA那樣進行酶切，但也需要變性。它首先用合適的限制性內切核酸酶將DNA切割，進行電泳分離后，利用干燥的吸水紙產生毛細作用，使液體經過凝膠，從而使DNA片段由液流攜帶從凝膠轉移并結合在固體支持物表面。31．答： 1975年Southern建立起來的一種雜交方法，屬固相—液相雜交。30．答： 根據微孔濾膜雜交和原位雜交的原理而改良的一種篩選重組體的一種核酸雜交方法。29．答： 通過一定的物理學方法將DNA或RNA從凝膠上轉移到固體支持物，然后同液體中的探針進行雜交。28．答： 隨機引物是人工合成的長度為6個核苷酸的寡聚核苷酸片段群體，含有各種可能的排列順序(46=4096)；或是用DNA酶處理小牛胸腺DNA后獲得的6—12個堿基的片段。27．答： 這一方法的基本原理是根據抗體、抗原分子的三個基本特性而設計的一種篩選鑒定重組體的方法。經過環(huán)絲氨酸處理后，存活的細胞中tets型得到很大富集，而經過若干次連續(xù)處理，即能獲得在tetr基因內含有插人物的質粒的細胞。26．答： 原理： 由于四環(huán)素的作用只是抑制細菌蛋白質的合成，而不是殺死細菌；而氨基酸類似物環(huán)絲氨酸如果摻人蛋白質，則是致命的。將擬南芥的基因組DNA或cDNA分別克隆到酵母人工染色體(YAC)上作為定位或篩選的融合標簽，基因可以在酵母中作為細胞質蛋白質或分泌蛋白質進行表達。這對了解蛋白質的功能區(qū)是十分重要的，可以避免有關多肽翻譯后加工的一些問題。反應中通常要涉及三種不同的限制性內切核酸酶，其中兩種是識別六堿基的酶，另一種是識別四堿基的酶。由于連接體系中有原有的限制性內切核酸酶的存在，就不會發(fā)生載體自連，從而保證了載體同外源DNA的連接。 同裂酶產生的黏性末端雖然可以像完全親和的黏性末端那樣進行連接，但是它與完全親和的黏性末端連接不同的是，連接后的產物往往失去原有的限制性內切核酸酶的切點，但是能夠被另外一種同裂酶識別。23．答： 同裂酶是一類識別序列不完全相同，但是產生的黏性末端至少有四個堿基相同的限制性內切核酸酶。22．答： 將人工合成的或來源于現有質粒的一小段DNA分子(在這一小段DNA分子上有某種限制性內切核酸酶的識別序列)，加到載體或外源DNA的分子上，這樣便在載體DNA和外源DNA上制造出新的酶切點。由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會影響外源基因的表達。(3)用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進行連接。 同聚物加尾法實際上是一種人工黏性末端連接法，具有很多優(yōu)點：．(1)首先不易自身環(huán)化，這是因為同一種DNA的兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。OH端逐個添加單核苷酸，如果用Co2+作輔助因子則可在隱蔽的或平末端的339。OH上。21．答： 所謂同聚物加尾法就是利用末端轉移酶在載體及外源雙鏈DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA連接酶的作用下漣接成為重組的DNA。cDNA文庫與基因組文庫的主要差別是： (1)基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文庫克隆的是具有蛋白質產物的結構基因，包括調節(jié)基因； (2)基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調控因子的影響； (3)基因組文庫中的編碼基因是真實基因，含有內含子和外顯子；而eDNA克隆的是不含內含子的基因。由于細胞內的基因在表達的時間上并非是統(tǒng)一的，具有發(fā)育的階段性和時間性．有些則需要特殊的環(huán)境條件。選用適合的載體，將合成的cDNA重組導人寄主細胞，經篩選得到韻cDNA克隆群稱為cDNA文庫。19．答： 同mRNA互補的DNA稱為cDNA?；驇?gene pool)是指在進行有性生殖的某一群體中，能進行生殖的個體所含總的遺傳信息。一般以改造的噬菌體DNA或黏粒作為載體，包括下列過程：(1)高分子量染色體DNA的制備；(2)體外重組連接；(3)包裝蛋白的制備；(4)重組體的體外包裝；(5)將重組DNA導人寄主細胞；(6)篩選。一個基因文庫一旦建立，任一特定的克隆都可被回收用于研究其所攜帶的基因，因而在需要克隆某一特定基因時就避免了逐個巡查克隆的耗時過程?；蛘呃孟鄳目贵w從cDNA表達文庫中篩選相應的克隆。 輔助噬菌體必需具備如下條件： (1)助噬菌體的DNA IG區(qū)必需失去功能，其本身的DNA不會被包裝到成熟的噬菌體顆粒中； （2）由于輔助噬菌體的IG區(qū)失活，其本身的基因不能表達，要使輔助噬菌體的所有功能基因都能進行表達，必須在輔助噬菌體的基因組中導人新的復制起點； (3)輔助噬菌體的基因組中具有選擇標記，便于識別和收集一定數量的輔助噬菌體。 15．答： 雖然噬菌粒載體攜帶有M13的IG區(qū)，能夠合成單鏈DNA，但是它沒有M13的功能基因，沒有M13基因2的產物存在，所以不能合成單鏈DNA。另外由于不同大小的插入片段對宿主細胞的作用不同，會造成文庫擴增量的比例失調。 黏粒載體也有如下不足：(1)如果兩個黏粒之間有同源序列，可能會發(fā)生重組，結果會使被克隆的片段重排或丟失。 (5)簡化了篩選。 (4)容載能力大。 (2)具有質粒載體的抗生素抗性基因的選擇標記。 (2)單鏈載體分子感染的細胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。 (3)單鏈DNA和雙鏈DNA都可以轉染宿主，并可根據人工加上的選擇標記進行篩選。13．答 M13克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點： (1)克隆的片段大：M13噬菌體的DNA在包裝時不受體積的限制，所以容載能力大，有報道，有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體DNA長6—7倍的DNA(插人片段可達40kb)。這種插入物的長度可達幾百個堿基對。如果插入的外源DNA引起a肽的可讀框的改變，或者插入片段在正確的可讀框中含有終止密碼的話，就會形成白色噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重組的噬菌體將喪失分解Xgal的能力，轉入lac宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷 (Xgal)平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍色噬菌斑。11．答： 這種方法是根據組織化學的原理來篩選重組體。 (3)沒有可供選擇的標記。10． 答： (1)菌體DNA沒有容載能力，因為噬菌體的頭部對DNA包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105％，所以要將l噬菌體改造成載體，必須削減分子量。(3)一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組，因為重組后有可能給宿主帶來突變。對于多數基因克隆操作來說，都不希望載體能夠進行自主傳遞，也不希望被帶動轉移。這些系統(tǒng)使細胞對質粒產生溺愛，并防止細胞丟失質粒。如果一個細胞丟失了質粒，既沒有毒性蛋白也沒有解毒劑的合成。為什么毒性蛋白僅僅是在細胞丟失了質粒之后立即殺死細胞?當細胞含有這種質粒時，沉溺系統(tǒng)的蛋白質或RNA可作為一種解毒藥，既能阻止毒蛋白的合成，又能同毒蛋白結合并阻止毒蛋白起作用。 例如，質粒的毒性蛋白Ccd,通過改變DNA螺旋酶來殺死細胞，由于螺旋酶的改編，引起了雙螺旋DNA的斷裂。這些質粒編碼一些毒性蛋白質，這些蛋白質一旦表達就會殺死細胞。在一類復仇的細胞中，質粒能夠編碼一些殺死丟失了質粒的細胞。可能是增強了質粒分離后的迅速復制，防止了下次分裂時的丟失。高拷貝數的質粒常常具有增加質粒適當分離的位點，但是這些區(qū)域并沒有相同的結構，并不以相同的機制起作用。 模型B同模型A基本類似，在這個模型中，質粒的兩個拷貝在同質膜結合之前必須通過它們的par位點相互配對。染色體上有很多的位點，并且隨著DNA的復制而加倍，這些位點可供質粒結合。 將模型A稍微改動一下，就可以滿足質粒分離所需的位點。這就保證了質粒不會丟失。當細胞生長時，位點也加倍，每一個質?？截惤Y合一個位點。 模型．A：par位點同細菌質膜的一個假定位點結合。par位點是質粒同質膜結合的區(qū)域，在細胞分裂時，由于膜的生長，質粒的兩個拷貝就被拉到兩個子細胞中。已經深入研究過P1質粒的分離系統(tǒng)，發(fā)現P1質粒的分離系統(tǒng)由一個順式激活par序列和兩個蛋白ParA和，ParB的基因構成，其中一個蛋白同par位點結合。 所謂par功能是指某些質粒，包括F、R1等質粒上具有的一些短的區(qū)域，這些區(qū)域能夠增強質?？截惖暮线m分配。為了避免這種情況的發(fā)生，很多質粒都具有位點專一性重組的系統(tǒng)，可以破壞多聚體。多聚體的形成可能是由于在復制終止時發(fā)生錯誤或者是由于單體間重組的結果。8．答： 質粒通過以下幾種機制維持在細胞中的穩(wěn)定： (1)多聚體質粒的分解 如果質粒在復制時形成多聚體的話，在細胞分裂過程中質粒丟失的可能性就會增加。7．答： DNase I是一種內切核酸酶，在Mg2+存在下，DNase I隨機切割DNA兩條鏈中的任意一條鏈；當Mn2+代替Mg2+時，DNase I幾乎是在雙鏈DNA兩條鏈相對的位置上打開缺口，使雙鏈DNA斷裂，產生的末端幾乎是平末端或只突出1～2個核苷酸的DNA片段。在基因工程中主要用于除去雙鏈DNA突出的539。不能切割帶切口或缺口的dsDNA。端。單核苷酸，作用底物是雙鏈DNA的539。 (2)DNA和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進行末端標記。端脫磷酸，防止DNA的自身連接。C穩(wěn)定，且耐酚抽提。5．答： 主要差別是：CIP68176。外切核酸酶活性較強。不過這一反應用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的339。)作用達到平衡。)作用與聚合(539。隱含末端，然后在高濃度的標記底物( 32pdNTP)存在下，使降解(339。的外切核酸酶活性除去339。突出末端(protruding end) 該反應分兩步進行：先用339。突