【正文】 為此，我們整合國內(nèi)優(yōu)秀團(tuán)隊(duì)，利用當(dāng)前最先進(jìn)的研究手段和技術(shù)，從細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育學(xué)、基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)和生物信息學(xué)等方面進(jìn)行研究。本研究團(tuán)隊(duì)在 iPS 誘導(dǎo)技術(shù)方面已經(jīng)有豐富的經(jīng)驗(yàn)，將結(jié)合不同 iPS 比較研 究的結(jié)果，結(jié)合優(yōu)化轉(zhuǎn)作子、優(yōu)化蛋白導(dǎo)入系統(tǒng)和小分子化合物，最終建立安全高效的 iPS 技術(shù)；并通過建立帶有造血報(bào)告基因的iPS 細(xì)胞系，篩選能夠促進(jìn)造血分化的小分化合物和支撐細(xì)胞，最終建立高效的人 iPS 細(xì)胞想造血分化新技術(shù)，為最終的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。地中海貧血疾病常見突變位點(diǎn)的修復(fù)技術(shù)，為將來臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 3．在疾病 iPS 細(xì)胞突變基因定點(diǎn)修復(fù)方面：遺傳疾病來源的 iPS 細(xì)胞最終應(yīng)用的臨床， 必須首先修復(fù)其攜帶的突變基因。 主要研究內(nèi)容： 1．不同來源 iPS 細(xì)胞異同比較方 面：通過分別收集不同來源 iPS 細(xì)胞和其來源細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞，利用全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)、組蛋白修飾檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄本測(cè)序技術(shù)，建立其表觀和轉(zhuǎn)錄水平全景信息庫，并通過比較分析，確定不同來源 iPS 和胚胎干細(xì)胞之間是否存在差異，這些差異是否帶有其來源組織記憶，這些差異存在的機(jī)理及意義是什么，指導(dǎo) iPS 細(xì)胞的臨床應(yīng)用并為其它 iPS 研究提供分析依據(jù)。 3．遺傳疾病來源的 iPS 細(xì)胞，其本身仍然帶有自身的突變基因，應(yīng)用它來治療本身的疾病，必須要將突變基因進(jìn)行修復(fù)，如何高效的達(dá)到突變基因的定點(diǎn)修復(fù)具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。 、不同細(xì)胞（甚至是不同疾病患者）來源獲得的人 iPS 細(xì)胞，它們之間是否有區(qū)別，是否帶有來源組織的表觀遺傳記憶？它們與人胚胎干細(xì)胞是否真的非常相似？它們?cè)诜只臅r(shí)候是否因此會(huì)有區(qū)別？這種差異性是如何調(diào)控的？其確切的機(jī)制如何 ?對(duì)于以上問題的解答，將可能使我們能夠更加清晰，更加精確的了解 iPS，為將來 iPS 的臨床應(yīng)用提供選擇標(biāo)準(zhǔn)，如何選擇，選擇怎樣的 iPS 細(xì)胞應(yīng)用于哪一特定方面，并同時(shí)為 iPS 研究提供一個(gè)不同來源 iPS細(xì)胞表觀和轉(zhuǎn)錄水平的全景信息庫。地中海貧血等的治療方面帶來重大突破，具有重大理論和應(yīng)用價(jià)值。 4 確立高效穩(wěn)定、無動(dòng)物源性非病毒的最優(yōu) iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)，并建成高效造血分化新方法。 預(yù)期目標(biāo)： 1 完成不同來源 iPS細(xì)胞全景分析，系統(tǒng)分析其異同的影響機(jī)理，并對(duì)其中期關(guān)鍵作用 25個(gè)因子作用機(jī)理深入闡述 2 建立腫瘤基質(zhì)微環(huán)境體外研 究平臺(tái)和腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生的模擬體系，探索腫瘤形成的細(xì)胞機(jī)制。 4 對(duì)篩選的鋅核酸酶修復(fù)后 iPS細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性及多能性進(jìn)行鑒定。 2 利用已建株的基質(zhì)細(xì)胞模擬腫瘤基質(zhì)微環(huán)境，研究其對(duì) iPS細(xì)胞誘導(dǎo)和再分化的影響。 7 建立無動(dòng)物源性的 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)，同時(shí)提高 iPS細(xì)胞造血分化效率。 5 確認(rèn) iPS重編程過程對(duì) SSO修復(fù)后的細(xì)胞增殖影響。 2 確認(rèn) 35個(gè)不同來源 iPS差異關(guān)鍵因子，展開其功能研究。 6 進(jìn)一步探索提高 iPS細(xì)胞造血分化效率的新方法。 4 將篩選的鋅指核酸酶修復(fù)患者來源的 iPS細(xì)胞。 2020年 1月 12月 研究內(nèi)容： 1 根據(jù)不同來源 iPS異同關(guān)鍵因子分析，分析新方法獲得 iPS特點(diǎn)，研究分化后獲得細(xì)胞特點(diǎn)。 3 發(fā)現(xiàn)在 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的過程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑、某些基因發(fā)生重編程的特殊環(huán)境下對(duì) SSO介導(dǎo)的基因定點(diǎn)修復(fù)效率的影響。 5 使用鋅指核酸酶對(duì)地中海貧血患者 iPS細(xì)胞中突變等位基因進(jìn)行原位矯正。 3 研究誘導(dǎo)機(jī)體不同的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 iPS細(xì)胞的方法，免疫原性和致瘤率的影響及相關(guān)機(jī)制。 2020年 1月 12月 研究內(nèi)容： 1 匯總綜合不同來源 iPS數(shù)據(jù)，利用 重硫酸鹽測(cè)序等方法進(jìn)行驗(yàn)證。 6 確定鋅指核酸酶在人培養(yǎng)細(xì)胞中的有效性和特異性并排除其細(xì)胞毒性。 3 完成不同 成體細(xì)胞來源的 iPS細(xì)胞在誘導(dǎo)以及再分化過程免疫原性變化的基因和蛋白水平的全景分析 4 明確 35個(gè)影響 iPS細(xì)胞在誘導(dǎo)以及再分化過程免疫原性變化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子和分子。 預(yù)期目標(biāo)： 1 完成 10~15株 iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本測(cè)序，獲得數(shù)據(jù)分析比對(duì)。 5 構(gòu)建含有地中海貧血突變位點(diǎn)的細(xì)胞篩選平臺(tái)，并利用該平臺(tái)確定鋅指核酸酶在人培養(yǎng)細(xì)胞中的有效性和特異性。 2020年 1月 12月 研究內(nèi)容： 1 擴(kuò)大不同方法和疾病來源 iPS細(xì)胞收集，如非病毒系統(tǒng)獲得 iPS細(xì)胞，通過高通量測(cè)序與單基因分析方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本和表觀遺傳分析。 6 構(gòu)建模擬引起地中海貧血的點(diǎn)突變，通過酶切鑒定，測(cè)序以及在細(xì)胞水平確認(rèn)構(gòu)建的綠色熒光報(bào)告基因系統(tǒng)是否構(gòu)建正確。 4 建立小鼠和人不同組織的基質(zhì)細(xì)胞庫。 2 完成 10~15株 iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本測(cè)序。 7 收集不同時(shí)期的骨髓細(xì)胞，以備后期建立 iPS細(xì)胞造血分化新方法使用。 5 針對(duì)地中海貧血特定突變位點(diǎn)鋅指文庫的設(shè)計(jì)組裝與在細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)中的篩選。 3 培養(yǎng)小鼠和人的基質(zhì)細(xì)胞并建株，設(shè)計(jì)不同的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境誘導(dǎo)iPS細(xì)胞再分化。 經(jīng)費(fèi)比例： 15% 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 課題負(fù)責(zé)人： 蔡景蕾 學(xué)術(shù)骨干： 蔡道章、陳 燊 、甘 燚 四、年度計(jì)劃 2020年 1月 12月 研究內(nèi)容： 1 收集不同組織來源 iPS細(xì)胞，收集其 DNA、 RNA等，通過高通量測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本和表觀遺傳分析。 建立高效誘導(dǎo)造血技術(shù) 結(jié)合篩選出的小分子化合物與支持細(xì)胞，建立高效誘導(dǎo) iPS或胚胎干細(xì)胞向造血分化技術(shù)。 利用造血報(bào)告細(xì)胞系篩選小分子化合物 利用帶有報(bào)告基因的 iPS或胚胎干細(xì)胞系，篩選能夠促進(jìn)造血分化的細(xì)胞系。首先建立帶有造血報(bào)告基因 iPS細(xì)胞系，并以此篩選能夠促進(jìn)造血分化的小分子化合物或者支撐細(xì)胞，最終建立高效的人iPS造血分化平臺(tái)。 建立高效安全人 iPS體系。 篩選具有提高 iPS誘導(dǎo)效率的小分子化合物。文獻(xiàn)報(bào)道蛋白形式 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)的效率比較低，這主要與蛋白遞送肽的性質(zhì)和效率有關(guān)。 蛋白 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)。 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)。 研究內(nèi)容： 1 建立高效安全人 iPS誘導(dǎo)技術(shù)。對(duì)篩選的 iPS細(xì)胞進(jìn)行多能性鑒定，包括： PCR鑒定內(nèi)源性標(biāo)記基因的表達(dá)，分化能力的鑒定。對(duì)篩選的 iPS細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定。將第二部分篩選的鋅指組合與線性化供體 DNA通過高效的 Amaxa核轉(zhuǎn)染儀轉(zhuǎn)染到患者來源的 iPS細(xì)胞。序列正確的質(zhì)?？寺⌒枰ㄟ^質(zhì)粒大量制備，準(zhǔn)備用于細(xì)胞內(nèi)原位重組。 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已有的 beta地中海貧血患者 iPS細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染鋅指核酸酶表達(dá)質(zhì)粒和供體質(zhì)粒到含有正常位點(diǎn)的穩(wěn)定細(xì)胞株，通過觀察是否有綠色熒 光蛋白表達(dá)的細(xì)胞來判定所選鋅指不識(shí)別正常的 beta－球蛋白基因序列，進(jìn)而確定特異識(shí)別相應(yīng)突變位點(diǎn)的鋅指核酸酶。 2 構(gòu)建含有 beta－地中海貧血突變位點(diǎn)的細(xì)胞篩選平臺(tái)，并利用該平臺(tái)確定鋅指核酸酶在人培養(yǎng)細(xì)胞中的有效性和特異性。 II 鋅指核酸酶技術(shù)修復(fù) 223。同時(shí)在誘導(dǎo)過程中加入 SSO修復(fù)突變基因，觀察修復(fù)后 iPS細(xì)胞的增殖情況。 3 把 iPS細(xì)胞作為 SSO的修復(fù)對(duì)象，利用 iPS細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性，使修復(fù)后的細(xì)胞能夠有效增殖。 驗(yàn)證重編程過程中利用 SSO技術(shù)修復(fù)基因 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠后，取具有點(diǎn)突變 mGFP的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，選擇合適的條件誘導(dǎo)其為 iPS細(xì)胞。以 EGFP作為檢測(cè)標(biāo)志，模擬引起地中海貧血的點(diǎn)突變，包括剪接位點(diǎn)突變、無義突變、加尾信號(hào)突變等基因突變類型構(gòu)建報(bào)告基因載體。 研究內(nèi)容： I SSO修復(fù)技術(shù)驗(yàn)證模型建立和 223。 經(jīng)費(fèi)比例： 30% 承擔(dān)單位： 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院 課題負(fù)責(zé)人： 韓巖梅 學(xué)術(shù)骨干： 秦大江、郭振紅、錢程、蘇小平 課題 3 ： 疾病來源 iPS的表觀調(diào)控與突變基因定點(diǎn)修復(fù)研究 研究目標(biāo)： 借助 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)過程中表觀遺傳學(xué)的改變和 iPS細(xì)胞的干細(xì)胞特性提高 SSO的修復(fù)效率和解決 SSO修復(fù)細(xì)胞后的增殖問題，同時(shí)利用 SSO和鋅指核酸酶技術(shù)建立 223。 4 基質(zhì)微環(huán)境對(duì) iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，免疫原性和致瘤率的影響及相關(guān)機(jī)制研究：利用實(shí)驗(yàn)室已有的基質(zhì)細(xì)胞株模擬基質(zhì)微環(huán)境，探索基質(zhì)微環(huán)境存在與否對(duì) iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響，并通過已有的研究平臺(tái)檢測(cè)基質(zhì)微環(huán)境對(duì) iPS細(xì)胞免疫原性，致瘤率以及再分 化的影響，并深入研究其相關(guān)機(jī)制。 2 iPS細(xì)胞免疫原性全景分析：監(jiān)測(cè)不同成體細(xì)胞來源的 iPS細(xì)胞以及 iPS細(xì)胞在再分化過程免疫原性的變化，通過蛋白表達(dá)譜分析和表觀遺傳學(xué)分析在蛋白和基因不同水平檢測(cè)影響 iPS細(xì)胞免疫原性的關(guān)鍵因素，并 在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究免疫干預(yù)方法。 研究內(nèi)容： iPS細(xì)胞免疫原性全景分析 , iPS細(xì)胞來源和基質(zhì)微環(huán)境對(duì) iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，免疫原性和致瘤率的影響及相關(guān)機(jī)制研究 1 誘導(dǎo)制備不同成體細(xì)胞來源的 iPS細(xì)胞 ,特別是免疫細(xì)胞來源 ,建立 iPS細(xì)胞庫 。 4 綜合分析用以上三種方法獲得的數(shù)據(jù)，繪出 iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞相比的表觀和轉(zhuǎn)錄水平全景圖，對(duì)不同來源 iPS及其來源細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳水平進(jìn)行全景分析，比較其同異。 3 對(duì)不同來源 iPS及其來源細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞組蛋白修飾分析。對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較不同來源iPS及其來源細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞全基因組轉(zhuǎn)錄本同異。將提取的 RNA質(zhì)量檢測(cè)合格后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄成 cDNA。 2 對(duì)不同來源 iPS及其來源細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞全基因組轉(zhuǎn)錄本分析。處理后的 DNA利用 Solexa測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較不同來源 iPS及其來源細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞全基因組甲基化信息同異。通過收集提取通過標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一方法建立的不同組織來源，如胎盤、臍帶、皮膚等的 iPS及其來源細(xì)胞，及胚 胎干細(xì)胞系 H H9 基因組 DNA。 課題設(shè)置： 課題 1 ： 不同組織與疾病 來源 iPS細(xì)胞全基因組表觀遺傳及轉(zhuǎn)錄 本差異分析與機(jī)制研究 研究目標(biāo)： 利用全基因組甲基化測(cè)序、轉(zhuǎn)錄本測(cè)序及組蛋白修飾分析技術(shù)，得到人 iPS表觀和轉(zhuǎn)錄水平全景圖，確定不同來源 iPS和胚胎干細(xì)胞之間是否存在差異，這些差異是否帶有其來源組織記憶，這些差異存在的機(jī)理及意義是什么，為指導(dǎo) iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用并為其它 iPS研究提供分析依據(jù)，使我國在這一研究領(lǐng)域在國際上產(chǎn)生重要影響。 因此，本項(xiàng)目的四個(gè)課題本身具有密切的內(nèi)在聯(lián)系，課題一的完成將為課題二、三、四的完成奠定基礎(chǔ)，課題二、課題三的完成也將可能為課題四提供新的思路，課題四的工作也可能為其他三個(gè)課題的完成提供新的方法并促進(jìn)其他三個(gè)課題的完成。因此結(jié)合課題一“不同組 織與疾病來源 iPS細(xì)胞全基因組表觀遺傳及轉(zhuǎn)錄本差異分析與機(jī)制研究”中的全基因組表觀遺傳的研究成果有望借助 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)過程中開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等表觀遺傳學(xué)狀態(tài)的改變提高修復(fù)效率，修復(fù)后的疾病來源的 iPS細(xì)胞尚需借助課題二“不同組織與疾病重編程過程中的免疫源性全景分析與機(jī)制研究”中建立的實(shí)驗(yàn)方法和手段檢測(cè)其免疫原性是否改變，是否可以用于回輸患者體內(nèi)而無免疫原性問題，借助課題四“基于多能性差異機(jī)制的安全高效重編程及造血細(xì)胞定向分化新技術(shù)探索”中建立的高效重編程和定向分化的新技術(shù)可以高效率的誘導(dǎo)分化修復(fù)后的 iPS細(xì) 胞向特定細(xì)胞分化，達(dá)到回輸體內(nèi)治療遺傳性疾病的目的。 SSO介導(dǎo)的基因定點(diǎn)修復(fù)和鋅指核酸酶技術(shù)，具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)高度開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)更有利于 SSO與靶位點(diǎn)結(jié)合，募集修復(fù)蛋白。這些問題的回答都為最終 iPS技術(shù)的臨床應(yīng)用做準(zhǔn)備。 各課題間相互關(guān)系： 本研究將針對(duì)不同來源 iPS細(xì)胞同異這一根本問題，首先在課題一中通過全基因組甲基化測(cè)序分析，轉(zhuǎn)錄本測(cè)序分析及組蛋白分析等技術(shù)，對(duì)不同來源的 iPS細(xì)胞進(jìn)行全景分析，系統(tǒng)的比較不同來源人 iPS細(xì)胞之間的同異，并為其它課題和研究提供人 iPS表觀和轉(zhuǎn)錄水平全景的數(shù)據(jù)庫。上述條件都將保 證申請(qǐng)項(xiàng)目的順利實(shí)施和完成。本項(xiàng)目的承擔(dān)單位具有高效的管理系統(tǒng)、專業(yè)的技術(shù)支撐系統(tǒng)、優(yōu)秀的研究生生源。 5 承擔(dān)單位具有完成項(xiàng)目的條件 依托單位中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院是國內(nèi)率先開展 iPS研究單位，并一致致力于 iPS技術(shù)在我國的推廣與普及。 4 承擔(dān)者具有完成項(xiàng)目的能力 項(xiàng)目負(fù)責(zé)人艾梅格 (Miguel Esteban)博士在國外學(xué)習(xí)工作期間主要從事腫瘤和代謝方面研究， 2020年底受聘為中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院全職研究員，結(jié)合自身研究經(jīng)驗(yàn)在 iPS研究方面取得突出成績，相關(guān)論文發(fā)表在 Cell Stem Cell等雜志；課題負(fù)責(zé)人韓巖梅博士是全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文獲得者，在免疫學(xué)研究方面做過大量 工作，作為第一負(fù)責(zé)人在國內(nèi)完成的工作在 Blood發(fā)表；課題負(fù)責(zé)人黃粵教授從 1997年以來一直從事實(shí)驗(yàn)小鼠動(dòng)物模型和胚胎干細(xì)胞的研究工作，在包括 Genome Research, PNAS, Circulation， JBC在內(nèi)的國際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表十幾篇研究論文，有很好的工作基礎(chǔ)；課題負(fù)責(zé)人蔡景蕾副研究員長期