【正文】 項目負責人艾梅格 (Miguel Esteban)博士在國外學習工作期間主要從事腫瘤和代謝方面研究， 2020年底受聘為中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院全職研究員，結合自身研究經驗在 iPS研究方面取得突出成績，相關論文發(fā)表在 Cell Stem Cell等雜志；課題負責人韓巖梅博士是全國優(yōu)秀博士學位論文獲得者，在免疫學研究方面做過大量 工作，作為第一負責人在國內完成的工作在 Blood發(fā)表；課題負責人黃粵教授從 1997年以來一直從事實驗小鼠動物模型和胚胎干細胞的研究工作，在包括 Genome Research, PNAS, Circulation， JBC在內的國際學術期刊發(fā)表十幾篇研究論文，有很好的工作基礎；課題負責人蔡景蕾副研究員長期從事器官發(fā)生發(fā)育及再生領域的研究， 2020年至今在中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院工作，主要從事誘導多能干細胞（ iPS）的誘導與分化機制、牙齒發(fā)生發(fā)育再生的研究。此外，課題組骨干多是在一線工作的青年科技工作者 。 5 承擔單位具有完成項目的條件 依托單位中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院是國內率先開展 iPS研究單位，并一致致力于 iPS技術在我國的推廣與普及。目前本依托單位十分重視本項目的申請和誘導多能干細胞（ iPS）技術的疾病模型與機理研究方面的相關研究，并已提供了很好的前期工作條件，包括場地、設備、人員和經費支持等。本項目的承擔單位具有高效的管理系統(tǒng)、專業(yè)的技術支撐系統(tǒng)、優(yōu)秀的研究生生源。項目參加人員長期以來得到了國家科技部、中科院、自然科學基金委員會和地方政府等的大力支持，均能圓滿完成科研任務。上述條件都將保 證申請項目的順利實施和完成。課題參加單位第二軍醫(yī)大學免疫學研究所和中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所均為國家重點實驗室，具備完成本項目課題的條件。 各課題間相互關系： 本研究將針對不同來源 iPS細胞同異這一根本問題，首先在課題一中通過全基因組甲基化測序分析，轉錄本測序分析及組蛋白分析等技術，對不同來源的 iPS細胞進行全景分析，系統(tǒng)的比較不同來源人 iPS細胞之間的同異，并為其它課題和研究提供人 iPS表觀和轉錄水平全景的數據庫。課題二通過對重編程過程中的免疫源性變化及不同組織來源 iPS免疫源性區(qū)別進行全面的分析， 與課題一中結果相驗證，系統(tǒng)的分析重編程中免疫源性變化這一科學問題。這些問題的回答都為最終 iPS技術的臨床應用做準備。對于基因突變的遺傳性疾病，如果應用 iPS治療，就要取其自身來源的體細胞誘導成為 iPS，該細胞中仍然存在基因突變，這個突變的基因位點在治療前必須被修復。 SSO介導的基因定點修復和鋅指核酸酶技術，具有明顯的技術優(yōu)勢，本課題組前期的研究發(fā)現高度開放的染色質結構更有利于 SSO與靶位點結合，募集修復蛋白。 iPS細胞在誘導的過程中存在一個染色質結構重塑、某些基因發(fā)生重編程的特殊環(huán)境。因此結合課題一“不同組 織與疾病來源 iPS細胞全基因組表觀遺傳及轉錄本差異分析與機制研究”中的全基因組表觀遺傳的研究成果有望借助 iPS細胞誘導過程中開放的染色質結構等表觀遺傳學狀態(tài)的改變提高修復效率，修復后的疾病來源的 iPS細胞尚需借助課題二“不同組織與疾病重編程過程中的免疫源性全景分析與機制研究”中建立的實驗方法和手段檢測其免疫原性是否改變，是否可以用于回輸患者體內而無免疫原性問題，借助課題四“基于多能性差異機制的安全高效重編程及造血細胞定向分化新技術探索”中建立的高效重編程和定向分化的新技術可以高效率的誘導分化修復后的 iPS細 胞向特定細胞分化，達到回輸體內治療遺傳性疾病的目的。通過這四個課題的緊密有機合作為點突變遺傳病患者的治療提供新的治療手段。 因此，本項目的四個課題本身具有密切的內在聯系，課題一的完成將為課題二、三、四的完成奠定基礎，課題二、課題三的完成也將可能為課題四提供新的思路，課題四的工作也可能為其他三個課題的完成提供新的方法并促進其他三個課題的完成?？傊@些課題緊緊圍繞本項目擬解決的關鍵科學問題，有望在 iPS研究方面取得進展乃至突破。 課題設置： 課題 1 ： 不同組織與疾病 來源 iPS細胞全基因組表觀遺傳及轉錄 本差異分析與機制研究 研究目標： 利用全基因組甲基化測序、轉錄本測序及組蛋白修飾分析技術，得到人 iPS表觀和轉錄水平全景圖，確定不同來源 iPS和胚胎干細胞之間是否存在差異，這些差異是否帶有其來源組織記憶，這些差異存在的機理及意義是什么，為指導 iPS細胞的臨床應用并為其它 iPS研究提供分析依據，使我國在這一研究領域在國際上產生重要影響。 研究內容： 1 對不同來源 iPS及其來源細胞、胚胎干細胞全基因組甲基化分析。通過收集提取通過標準統(tǒng)一方法建立的不同組織來源，如胎盤、臍帶、皮膚等的 iPS及其來源細胞，及胚 胎干細胞系 H H9 基因組 DNA。提取的 DNA質量檢測合格后進行重硫酸鹽處理。處理后的 DNA利用 Solexa測序儀進行測序，對所獲得的數據進行分析，比較不同來源 iPS及其來源細胞、胚胎干細胞全基因組甲基化信息同異。對尋找到的關鍵基因進行重硫酸鹽測序法驗證。 2 對不同來源 iPS及其來源細胞、胚胎干細胞全基因組轉錄本分析。收集提取實驗室已建立的不同組織來源，如胎盤、臍帶、皮膚來源 iPS及其來源細胞，胚胎干細胞系 H H9 RNA。將提取的 RNA質量檢測合格后進行轉錄成 cDNA。將獲得的 cDNA利用 Solexa測序儀進行測序。對所獲得的數據進行分析，比較不同來源iPS及其來源細胞、胚胎干細胞全基因組轉錄本同異。對尋找到的關鍵基因進行實時定量 PCR測序。 3 對不同來源 iPS及其來源細胞、胚胎干細胞組蛋白修飾分析。 利用不同抗體，用免疫共沉淀技術將不同組蛋白修飾的 DNA片段拉下來，利用 Solexa測序儀進行測序。 4 綜合分析用以上三種方法獲得的數據，繪出 iPS細胞與胚胎干細胞相比的表觀和轉錄水平全景圖，對不同來源 iPS及其來源細胞、胚胎干細胞進行轉錄和表觀遺傳水平進行全景分析，比較其同異。 經費比例： 35% 承擔單位： 中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、中國科學院北京基因組研究所、南方醫(yī)科大學 課題負責人： Miguel Esteban 學術骨干： 吳佳妍、鐘梅、趙東宇、徐建勇 課題 2 ： 不同組織與疾病重編程過程中的免疫源性全景分析與機制研究 研究目標： 通過研究 iPS細胞在再分化過程免疫原性的變化以及在蛋白和基因水平檢測影響 iPS細胞免疫原性的關鍵因素，完成 iPS細胞的免疫原性全景分析；研究基質微環(huán)境在 iPS細胞誘導形成以及再分化階段的影響，研究如何誘導機體不同的免疫細胞轉化為 iPS細 胞的方法，從中篩選出最安全和最高效的優(yōu)化方案。 研究內容： iPS細胞免疫原性全景分析 , iPS細胞來源和基質微環(huán)境對 iPS細胞轉化率，免疫原性和致瘤率的影響及相關機制研究 1 誘導制備不同成體細胞來源的 iPS細胞 ,特別是免疫細胞來源 ,建立 iPS細胞庫 。設計不同的體內和體外實驗環(huán)境誘導 iPS細胞再分化。 2 iPS細胞免疫原性全景分析：監(jiān)測不同成體細胞來源的 iPS細胞以及 iPS細胞在再分化過程免疫原性的變化，通過蛋白表達譜分析和表觀遺傳學分析在蛋白和基因不同水平檢測影響 iPS細胞免疫原性的關鍵因素，并 在此基礎上進一步研究免疫干預方法。 3 iPS細胞來源對 iPS細胞轉化率，免疫原性和致瘤率的影響及相關機制研究：研究誘導機體不同的免疫細胞轉化為 iPS細胞的方法，以及不同 iPS細胞來源對 iPS細胞轉化率，免疫原性和致瘤率的影響及相關機制，從中篩選出最安全和最高效的優(yōu)化方案。 4 基質微環(huán)境對 iPS細胞轉化率，免疫原性和致瘤率的影響及相關機制研究：利用實驗室已有的基質細胞株模擬基質微環(huán)境，探索基質微環(huán)境存在與否對 iPS細胞轉化率的影響，并通過已有的研究平臺檢測基質微環(huán)境對 iPS細胞免疫原性，致瘤率以及再分 化的影響，并深入研究其相關機制。 5 研究腫瘤基質微環(huán)境對 iPS細胞誘導和再分化的影響，探索腫瘤干細胞的形成與腫瘤基質微環(huán)境的相關性：建立腫瘤基質微環(huán)境體外研究平臺，研究其對對 iPS細胞誘導和再分化的影響，并在此基礎上建立腫瘤干細胞產生的模擬體系，探索腫瘤形成的細胞機制，為腫瘤病因學研究和腫瘤治療奠定基礎。 經費比例： 30% 承擔單位： 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學、中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院 課題負責人： 韓巖梅 學術骨干： 秦大江、郭振紅、錢程、蘇小平 課題 3 ： 疾病來源 iPS的表觀調控與突變基因定點修復研究 研究目標： 借助 iPS細胞誘導過程中表觀遺傳學的改變和 iPS細胞的干細胞特性提高 SSO的修復效率和解決 SSO修復細胞后的增殖問題，同時利用 SSO和鋅指核酸酶技術建立 223。地中海貧血 iPS常見突變位點修復技術，最終為點突變遺傳性疾病的治療提供理論依據和實驗基礎。 研究內容： I SSO修復技術驗證模型建立和 223。地中海貧血 iPS常見突變位點修復 建立哺乳動物細胞熒光報告系統(tǒng)： 構建了帶有突變的 EGFP質粒載體（ mEGFP），該載體模擬了地中海貧血基因突變類型中的起始密碼突 變，將 EGFP的啟動子 ATG突變?yōu)?TTG，因此不能表達綠色熒光蛋白。以 EGFP作為檢測標志，模擬引起地中海貧血的點突變，包括剪接位點突變、無義突變、加尾信號突變等基因突變類型構建報告基因載體。構建含有這些突變類型報告基因的轉基因小鼠，這些小鼠的體細胞具有突變的 EGFP，因此不表達綠色熒光蛋白。 驗證重編程過程中利用 SSO技術修復基因 構建轉基因小鼠后，取具有點突變 mGFP的成纖維細胞培養(yǎng)，選擇合適的條件誘導其為 iPS細胞。在誘導過程中加入 SSO，在重編程的過程中用 SSO更為有效得修復 EGFP的突變位 點，并進一步對 iPS的形成和靶向性修復進行不同層次的鑒定。 3 把 iPS細胞作為 SSO的修復對象，利用 iPS細胞具有干細胞的特性，使修復后的細胞能夠有效增殖。本課題構建轉基因小鼠后，取具有點突變 mGFP的成纖維細胞培養(yǎng)，選擇合適的條件誘導其為 iPS細胞。同時在誘導過程中加入 SSO修復突變基因，觀察修復后 iPS細胞的增殖情況。 4 在上述工作的基礎上嘗試修復疾病來源的 iPS細胞中的突變基因，例如修復地中海貧血患者來源的 iPS細胞中的基因突變，并嘗試對修復后細胞的增殖和誘導分化。 II 鋅指核酸酶技術修復 223。地中海貧血 iPS常見突變位點 1 針對 beta－地中海貧血特定突變位點鋅指文庫的設計組裝與在細菌雙雜交系統(tǒng)中的篩選。 2 構建含有 beta－地中海貧血突變位點的細胞篩選平臺，并利用該平臺確定鋅指核酸酶在人培養(yǎng)細胞中的有效性和特異性。轉染鋅指核酸酶表達質粒和供體質粒到含有突變位點的穩(wěn)定細胞株，通過觀察和流式分析綠色熒光蛋白表達細胞的比例即可判定鋅指核酸酶的有效性，通過分析細胞凋亡的比例即可判定鋅指核酸酶作用的特異性和細胞毒性。轉染鋅指核酸酶表達質粒和供體質粒到含有正常位點的穩(wěn)定細胞株，通過觀察是否有綠色熒 光蛋白表達的細胞來判定所選鋅指不識別正常的 beta－球蛋白基因序列，進而確定特異識別相應突變位點的鋅指核酸酶。 3 使用鋅指核酸酶對 beta地中海貧血患者 iPS細胞中突變等位基因進行原位矯正。 對本實驗室已有的 beta地中海貧血患者 iPS細胞進行擴增培養(yǎng)。利用 PCR方法擴增得到不含任何突變的 beta珠蛋白基因供體 DNA（ donor DNA）片段，并將該 DNA片段插入到 T載體，得到的 TDonorDNA質粒進行測序鑒定。序列正確的質粒克隆需要通過質粒大量制備，準備用于細胞內原位重組。 對 TDonorDNA進行線性化處理以提高基因修復的效率，并同時可以去除載體骨架部分。將第二部分篩選的鋅指組合與線性化供體 DNA通過高效的 Amaxa核轉染儀轉染到患者來源的 iPS細胞。 iPS單克隆，然后通過 PCR測序方法和突變檢測試劑盒篩選鑒定已經糾正的 iPS細胞克隆。對篩選的 iPS細胞基因組的穩(wěn)定性進行鑒定。包括：核型分析，實驗所用質粒的非特異性插入。對篩選的 iPS細胞進行多能性鑒定，包括： PCR鑒定內源性標記基因的表達，分化能力的鑒定。 經費比例： 20% 承擔單位： 中國醫(yī)學科學院基 礎醫(yī)學研究所、中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院 課題負責人： 黃粵 學術骨干： 呂湘、李峰、董文吉、陳峰 課題 4 ： 基于多能性差異機制的安全高效重編程及造血細胞定向分化新技術探索 研究目標： 改進非病毒體系人 iPS誘導技術，結合附加體、蛋白及小分子化合物，探索出安全高效誘導體系；通過建立帶造血報告基因 iPS細胞系，篩選不同促進造血分化化合物及支撐細胞，建立高效造血分化新技術，為 iPS技術最終臨床應用提供基礎。 研究內容： 1 建立高效安全人 iPS誘導技術。通過啟動子優(yōu)化，誘導因子優(yōu)化等方法，改進 附加體誘導技術，同時探索通過改進蛋白遞送胎優(yōu)化蛋白誘導 iPS，同時結合表觀遺傳等分析結果，篩選能夠提高 iPS效率或替代因子小分子化合物，以上探索結果相結合最終建立高效安全的人 iPS誘導體系。