【導(dǎo)讀】各自優(yōu)勢(shì)，開(kāi)展從功能到結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)到小分子化合物的研究。在已有基礎(chǔ)上力爭(zhēng)：。胞治療提供前期工作基礎(chǔ)。運(yùn)的表觀遺傳調(diào)控蛋白及復(fù)合物；及相關(guān)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的解析；建立一套干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化和一套向肝細(xì)胞定向高效分化的技術(shù)。在細(xì)胞、動(dòng)物模型個(gè)體水平上分析胚胎干細(xì)胞體外定向分化細(xì)胞的有效。性及潛在風(fēng)險(xiǎn)的安全評(píng)估。6．在國(guó)際核心刊物及其他有影響力的學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文20-25篇,7．申請(qǐng)6項(xiàng)以上發(fā)明專利；8．培養(yǎng)博士研究生、博士后人員30人以上；蛋白及復(fù)合物在干細(xì)胞分化過(guò)程中的作用機(jī)制；白之間的表達(dá)差異，以及對(duì)這些蛋白的表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位進(jìn)行初步研究。掘其功能，找到重編程關(guān)鍵蛋白；化學(xué)水平鑒定心肌梗死的修復(fù)程度，并建立動(dòng)物體內(nèi)安全性評(píng)估體系。性并阻遏其蔓延的分子機(jī)理。最終得到符合晶體學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)。表面等中重要的位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變。利用生化、細(xì)胞水平

　　

【正文】 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)。 附加體質(zhì)粒可以在真核細(xì)胞中復(fù)制，并且其非整合特性預(yù)示著它將是安全的誘導(dǎo)系統(tǒng)之一。 蛋白 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)。 直接向細(xì)胞內(nèi)遞送蛋白形式的外源誘導(dǎo)因子是最為理想與安全的 iPS誘導(dǎo)方式。文獻(xiàn)報(bào)道蛋白形式 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)的效率比較低，這主要與蛋白遞送肽的性質(zhì)和效率有關(guān)。本研究將開(kāi)發(fā)新的一 系列蛋白遞送肽來(lái)提高iPS的效率。 篩選具有提高 iPS誘導(dǎo)效率的小分子化合物。 誘導(dǎo)已分化細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成為多能性干細(xì)胞需要關(guān)閉細(xì)胞的多個(gè)信號(hào)通路，目前有多個(gè)抑制信號(hào)通路的化合物。 建立高效安全人 iPS體系。 2 建立高效人 iPS造血分化技術(shù)。首先建立帶有造血報(bào)告基因 iPS細(xì)胞系，并以此篩選能夠促進(jìn)造血分化的小分子化合物或者支撐細(xì)胞，最終建立高效的人iPS造血分化平臺(tái)。 構(gòu)建帶有造血發(fā)育標(biāo)記的 ips細(xì)胞系 利用鋅指蛋白酶技術(shù)，在 iPS或胚胎干細(xì)胞細(xì)胞系造血 Marker，如 CD34等啟 動(dòng)子后加入 GFP報(bào)告基因，因此可以動(dòng)態(tài)的觀測(cè)分化的過(guò)程。 利用造血報(bào)告細(xì)胞系篩選小分子化合物 利用帶有報(bào)告基因的 iPS或胚胎干細(xì)胞系，篩選能夠促進(jìn)造血分化的細(xì)胞系。 利用造血報(bào)告細(xì)胞系篩選高效支持細(xì)胞 分離不同時(shí)期流產(chǎn)胎兒骨髓細(xì)胞，利用帶有報(bào)告基因 iPS或胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)，篩選出能高效誘導(dǎo)造血分化的支持細(xì)胞系。 建立高效誘導(dǎo)造血技術(shù) 結(jié)合篩選出的小分子化合物與支持細(xì)胞，建立高效誘導(dǎo) iPS或胚胎干細(xì)胞向造血分化技術(shù)。通過(guò)移植免疫缺陷鼠，檢測(cè)獲得的造血細(xì)胞功能。 經(jīng)費(fèi)比例： 15% 承擔(dān)單位： 中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 課題負(fù)責(zé)人： 蔡景蕾 學(xué)術(shù)骨干： 蔡道章、陳 燊 、甘 燚 四、年度計(jì)劃 2020年 1月 12月 研究?jī)?nèi)容： 1 收集不同組織來(lái)源 iPS細(xì)胞，收集其 DNA、 RNA等，通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本和表觀遺傳分析。 2 利用流式分選儀器分別純化小鼠和人的各種免疫細(xì)胞群，分別誘導(dǎo)制備不同成體細(xì)胞來(lái)源的 iPS細(xì)胞。 3 培養(yǎng)小鼠和人的基質(zhì)細(xì)胞并建株，設(shè)計(jì)不同的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境誘導(dǎo)iPS細(xì)胞再分化。 4 建立哺乳動(dòng)物細(xì)胞熒光報(bào)告系統(tǒng)， 并在細(xì)胞水平驗(yàn)證載體構(gòu)建是否正確。 5 針對(duì)地中海貧血特定突變位點(diǎn)鋅指文庫(kù)的設(shè)計(jì)組裝與在細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)中的篩選。 6 優(yōu)化附加體基因?qū)胂到y(tǒng)，開(kāi)發(fā)新的蛋白遞送肽，同時(shí)篩選像 Vc一樣具有提高 iPS誘導(dǎo)效率的小分子化合物。 7 收集不同時(shí)期的骨髓細(xì)胞，以備后期建立 iPS細(xì)胞造血分化新方法使用。 預(yù)期目標(biāo)： 1 完成 2株 iPS細(xì)胞的全基因組甲基化測(cè)序。 2 完成 10~15株 iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本測(cè)序。 3 建立小鼠和人不同免疫細(xì)胞來(lái)源地 iPS細(xì)胞庫(kù)。 4 建立小鼠和人不同組織的基質(zhì)細(xì)胞庫(kù)。 5 建立誘導(dǎo) iPS細(xì)胞再分 化的體外模擬體系。 6 構(gòu)建模擬引起地中海貧血的點(diǎn)突變，通過(guò)酶切鑒定，測(cè)序以及在細(xì)胞水平確認(rèn)構(gòu)建的綠色熒光報(bào)告基因系統(tǒng)是否構(gòu)建正確。 7 獲得非病毒系統(tǒng) iPS細(xì)胞并收集獲取不同時(shí)期的骨髓細(xì)胞以備后期建立造血分化平臺(tái)。 2020年 1月 12月 研究?jī)?nèi)容： 1 擴(kuò)大不同方法和疾病來(lái)源 iPS細(xì)胞收集，如非病毒系統(tǒng)獲得 iPS細(xì)胞，通過(guò)高通量測(cè)序與單基因分析方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本和表觀遺傳分析。 2 利用全基因分析高通量檢測(cè)不同成體細(xì)胞來(lái)源的 iPS細(xì)胞以及 iPS細(xì)胞在再分化過(guò)程免疫原性的變化 3 通過(guò)蛋白表達(dá)譜分析和表觀遺 傳學(xué)分析在蛋白和基因不同水平檢測(cè)影響iPS細(xì)胞免疫原性的關(guān)鍵因素 4 構(gòu)建含地中海貧血突變類型報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。 5 構(gòu)建含有地中海貧血突變位點(diǎn)的細(xì)胞篩選平臺(tái)，并利用該平臺(tái)確定鋅指核酸酶在人培養(yǎng)細(xì)胞中的有效性和特異性。 6 利用已經(jīng)成功建立的化合物等優(yōu)化非病毒 iPS系統(tǒng)誘導(dǎo)獲得 iPS細(xì)胞 7 過(guò)鋅指蛋白酶技術(shù)，構(gòu)建帶有造血發(fā)育標(biāo)記并可進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)分化的 iPS細(xì)胞系。 預(yù)期目標(biāo)： 1 完成 10~15株 iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本測(cè)序，獲得數(shù)據(jù)分析比對(duì)。 2 尋找到 25個(gè)關(guān)鍵影響不同 iPS差異的因子。 3 完成不同 成體細(xì)胞來(lái)源的 iPS細(xì)胞在誘導(dǎo)以及再分化過(guò)程免疫原性變化的基因和蛋白水平的全景分析 4 明確 35個(gè)影響 iPS細(xì)胞在誘導(dǎo)以及再分化過(guò)程免疫原性變化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子和分子。 5 得到含有突變類型報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過(guò) PCR等技術(shù)對(duì)構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行鑒定。 6 確定鋅指核酸酶在人培養(yǎng)細(xì)胞中的有效性和特異性并排除其細(xì)胞毒性。 7 構(gòu)建帶有造血發(fā)育標(biāo)記并可進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)分化的 iPS細(xì)胞系并以此篩選最適宜促進(jìn)造血分化的骨髓細(xì)胞（時(shí)期）。 2020年 1月 12月 研究?jī)?nèi)容： 1 匯總綜合不同來(lái)源 iPS數(shù)據(jù)，利用 重硫酸鹽測(cè)序等方法進(jìn)行驗(yàn)證。 2 結(jié)合項(xiàng)目總體進(jìn)展，補(bǔ)充部分必要 iPS細(xì)胞數(shù)據(jù)。 3 研究誘導(dǎo)機(jī)體不同的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 iPS細(xì)胞的方法，免疫原性和致瘤率的影響及相關(guān)機(jī)制。 4 驗(yàn)證重編程過(guò)程中利用 SSO技術(shù)修復(fù)基因。 5 使用鋅指核酸酶對(duì)地中海貧血患者 iPS細(xì)胞中突變等位基因進(jìn)行原位矯正。 6 進(jìn)一步優(yōu)化穩(wěn)定高效的非病毒 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng) 7 利用帶有報(bào)告基因的 iPS或胚胎干細(xì)胞系以及篩選獲得高效支持細(xì)胞（骨髓細(xì)胞）共培養(yǎng)，通過(guò)加入造血相關(guān)的各因子誘導(dǎo)造血分化， 預(yù)期目標(biāo)： 1 分析得到關(guān)鍵因子 5~10個(gè)進(jìn)行 深入研究其作用機(jī)理 2 篩選出誘導(dǎo)機(jī)體不同的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 iPS細(xì)胞安全和高效的優(yōu)化方案。 3 發(fā)現(xiàn)在 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的過(guò)程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑、某些基因發(fā)生重編程的特殊環(huán)境下對(duì) SSO介導(dǎo)的基因定點(diǎn)修復(fù)效率的影響。 4 初步建立 iPS細(xì)胞造血分化新方法。 2020年 1月 12月 研究?jī)?nèi)容： 1 根據(jù)不同來(lái)源 iPS異同關(guān)鍵因子分析，分析新方法獲得 iPS特點(diǎn)，研究分化后獲得細(xì)胞特點(diǎn)。 2 利用已建株的基質(zhì)細(xì)胞模擬基質(zhì)微環(huán)境，研究基質(zhì)微環(huán)境存在與否對(duì) iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響，并通過(guò)已有的研究平臺(tái)檢測(cè)基質(zhì)微環(huán)境對(duì) iPS細(xì) 胞免疫原性，致瘤率以及再分化的影響，并深入研究其相關(guān)機(jī)制； 3 取具有點(diǎn)突變 mGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細(xì)胞，在誘導(dǎo)過(guò)程中加入 SSO修復(fù)突變基因，觀察修復(fù)后 iPS細(xì)胞的增殖情況，在上述工作的基礎(chǔ)上嘗試修復(fù)疾病來(lái)源的 iPS細(xì)胞中的突變基因。 4 將篩選的鋅指核酸酶修復(fù)患者來(lái)源的 iPS細(xì)胞。 5 在非病毒 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，探索無(wú)動(dòng)物源性的培養(yǎng)基條件，同時(shí)探索在無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞條件下 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)的建立。 6 進(jìn)一步探索提高 iPS細(xì)胞造血分化效率的新方法。 預(yù)期目標(biāo)： 1 初步建立不同來(lái)源 iPS全景網(wǎng)絡(luò)圖。 2 確認(rèn) 35個(gè)不同來(lái)源 iPS差異關(guān)鍵因子，展開(kāi)其功能研究。 3 完成基質(zhì)微環(huán)境中 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)以及再分化研究的體外模擬體系 4 完成基質(zhì)微環(huán)境對(duì) iPS細(xì)胞誘導(dǎo)以及再分化過(guò)程免疫原性影響的機(jī)制研究。 5 確認(rèn) iPS重編程過(guò)程對(duì) SSO修復(fù)后的細(xì)胞增殖影響。 6 得出檢測(cè)鋅指核酸酶的修復(fù)突變效率，與 SSO介導(dǎo)的修復(fù)效率比較優(yōu)劣。 7 建立無(wú)動(dòng)物源性的 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)，同時(shí)提高 iPS細(xì)胞造血分化效率。 2020年 1月 8月 研究?jī)?nèi)容： 1 根據(jù)數(shù)據(jù)分析與關(guān)鍵因子功能研究，回饋到重編程過(guò)程，深入探討其作用機(jī)理。 2 利用已建株的基質(zhì)細(xì)胞模擬腫瘤基質(zhì)微環(huán)境，研究其對(duì) iPS細(xì)胞誘導(dǎo)和再分化的影響。 3 SSO修復(fù)后，對(duì) iPS的多能性和靶向性修復(fù)進(jìn)行不同層次的鑒定。 4 對(duì)篩選的鋅核酸酶修復(fù)后 iPS細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性及多能性進(jìn)行鑒定。 5 將各種 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行綜合優(yōu)化，確立高效穩(wěn)定、無(wú)動(dòng)物源性非病毒的最優(yōu) iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)，并在該基礎(chǔ)上建立高效的 iPS細(xì)胞造血分化新方法。 預(yù)期目標(biāo)： 1 完成不同來(lái)源 iPS細(xì)胞全景分析，系統(tǒng)分析其異同的影響機(jī)理，并對(duì)其中期關(guān)鍵作用 25個(gè)因子作用機(jī)理深入闡述 2 建立腫瘤基質(zhì)微環(huán)境體外研 究平臺(tái)和腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生的模擬體系，探索腫瘤形成的細(xì)胞機(jī)制。 3 成功增殖和誘導(dǎo)分化修復(fù)后疾病來(lái)源的 iPS細(xì)胞。 4 確立高效穩(wěn)定、無(wú)動(dòng)物源性非病毒的最優(yōu) iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)，并建成高效造血分化新方法。 一、研究?jī)?nèi)容 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題： iPS的研究和應(yīng)用將可能在多種影響人類健康的重大遺傳疾病包括 223。地中海貧血等的治療方面帶來(lái)重大突破，具有重大理論和應(yīng)用價(jià)值。本項(xiàng)目所針對(duì)的下述關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題的解決也將可能為 iPS 的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 、不同細(xì)胞（甚至是不同疾病患者）來(lái)源獲得的人 iPS 細(xì)胞，它們之間是否有區(qū)別，是否帶有來(lái)源組織的表觀遺傳記憶？它們與人胚胎干細(xì)胞是否真的非常相似？它們?cè)诜只臅r(shí)候是否因此會(huì)有區(qū)別？這種差異性是如何調(diào)控的？其確切的機(jī)制如何 ?對(duì)于以上問(wèn)題的解答，將可能使我們能夠更加清晰，更加精確的了解 iPS，為將來(lái) iPS 的臨床應(yīng)用提供選擇標(biāo)準(zhǔn)，如何選擇，選擇怎樣的 iPS 細(xì)胞應(yīng)用于哪一特定方面，并同時(shí)為 iPS 研究提供一個(gè)不同來(lái)源 iPS細(xì)胞表觀和轉(zhuǎn)錄水平的全景信息庫(kù)。 重編程過(guò)程中，是否會(huì)帶來(lái)其免疫原性的改變？其機(jī)制如何？這種改變是否會(huì)影響其在體內(nèi)的應(yīng)用？針對(duì)這種改變，如何有 效的通過(guò)免疫調(diào)控提高其使用的效率？該問(wèn)題的解決將可克服 iPS 在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)必然遭遇的難關(guān)，提高其治療效果并減少其應(yīng)用帶來(lái)的問(wèn)題。 3．遺傳疾病來(lái)源的 iPS 細(xì)胞，其本身仍然帶有自身的突變基因，應(yīng)用它來(lái)治療本身的疾病，必須要將突變基因進(jìn)行修復(fù)，如何高效的達(dá)到突變基因的定點(diǎn)修復(fù)具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。 4. iPS 技術(shù)最終要應(yīng)用到臨床，有兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題必須解決，一個(gè)是如何安全高效的獲得 iPS 細(xì)胞，另一個(gè)是如何將 iPS 細(xì)胞安全高效的定向誘導(dǎo)為為所需的細(xì)胞。 主要研究?jī)?nèi)容： 1．不同來(lái)源 iPS 細(xì)胞異同比較方 面：通過(guò)分別收集不同來(lái)源 iPS 細(xì)胞和其來(lái)源細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞，利用全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)、組蛋白修飾檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄本測(cè)序技術(shù)，建立其表觀和轉(zhuǎn)錄水平全景信息庫(kù)，并通過(guò)比較分析，確定不同來(lái)源 iPS 和胚胎干細(xì)胞之間是否存在差異，這些差異是否帶有其來(lái)源組織記憶，這些差異存在的機(jī)理及意義是什么，指導(dǎo) iPS 細(xì)胞的臨床應(yīng)用并為其它 iPS 研究提供分析依據(jù)。 2．在 iPS 細(xì)胞免疫原性全景分析和基質(zhì)微環(huán)境方面：監(jiān)測(cè)不同組織與疾病來(lái)源的 iPS 細(xì)胞在重編程和再分化過(guò)程免疫原性的變化，通過(guò)蛋白表達(dá)譜分析和表觀遺傳學(xué)分析在蛋白和基因不同水平 檢測(cè)影響 iPS 細(xì)胞免疫原性的關(guān)鍵因素，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究免疫干預(yù)方法；研究基質(zhì)微環(huán)境在 iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)形成以及再分化階段的影響，并探索其潛在機(jī)制，以達(dá)到提高 iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)成功率以及促進(jìn)其定向再分化并安全應(yīng)用于臨床治療；研究如何誘導(dǎo)機(jī)體不同的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 iPS 細(xì)胞的方法，以期從中篩選出最安全和最高效的優(yōu)化方案，同時(shí)通過(guò)機(jī)制研究深入探索成熟免疫細(xì)胞，造血干細(xì)胞， iPS 細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞之間的相互關(guān)系，轉(zhuǎn)化的可能性和相關(guān)機(jī)制。 3．在疾病 iPS 細(xì)胞突變基因定點(diǎn)修復(fù)方面：遺傳疾病來(lái)源的 iPS 細(xì)胞最終應(yīng)用的臨床， 必須首先修復(fù)其攜帶的突變基因。血液系統(tǒng)遺傳疾病可能是 iPS臨床移植治療能夠被最先應(yīng)用的領(lǐng)域，本課題將在探索利用單鏈寡核苷酸介導(dǎo)的靶向性基因定點(diǎn)修復(fù)技術(shù)的同時(shí)，利用 SSO 修復(fù)和鋅指核酸酶技術(shù)，分別探索建立 223。地中海貧血疾病常見(jiàn)突變位點(diǎn)的修復(fù)技術(shù)，為將來(lái)臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 4．在建立高效安全人 iPS 技術(shù)和 iPS 細(xì)胞高效向造血定向分化方面：探索iPS 技術(shù)應(yīng)用到臨床所必須解決的兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：首先要獲得安全高效的 iPS，然后能夠誘導(dǎo)其高效定向分化。本研究團(tuán)隊(duì)在 iPS 誘導(dǎo)技術(shù)方面已經(jīng)有豐富的經(jīng)驗(yàn)，將結(jié)合不同 iPS 比較研 究的結(jié)果，結(jié)合優(yōu)化轉(zhuǎn)作子、優(yōu)化蛋白導(dǎo)入系統(tǒng)和小分子化合物，最終建立安全高效的 iPS 技術(shù)；并通過(guò)建立帶有造血報(bào)告基因的iPS 細(xì)胞系，篩選能夠促進(jìn)造血分化的小分化合物和支撐細(xì)胞，最終建立高效的人 iPS 細(xì)胞想造血分化新技術(shù)，為最終的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 項(xiàng)目名稱： 人多能干細(xì)胞多能性維持和發(fā)育潛能差異的系統(tǒng)研究 首席科學(xué)家： 康九紅 同濟(jì)大學(xué) 起止年限： 至 依托部門(mén)： 教育部 上海市科委 二、預(yù)期目標(biāo) 總體目標(biāo)： 本項(xiàng)目以不同來(lái)源的 ES 和 iPS 細(xì)胞系為研究對(duì)象 ，以探索其多能性及穩(wěn)定維持、向特定譜系分化的潛能、臨床有效性及安全性差異的分子機(jī)制，并通過(guò)比較研究差異，建立 ES 和 iPS 細(xì)胞系在臨床應(yīng)用中的標(biāo)準(zhǔn)和根據(jù)不同目的篩選 ES和 iPS 細(xì)胞系的便捷方法為總體目標(biāo)。為此，我們整合國(guó)內(nèi)優(yōu)秀團(tuán)隊(duì)，利用當(dāng)前最先進(jìn)的研究手段和技術(shù)，從細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育學(xué)、基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)和生物信息學(xué)等方面進(jìn)行研究。通過(guò)本項(xiàng)目的實(shí)施，將獲得一批有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重要成果，提高國(guó)家科研實(shí)力，揭示 ES 和 iPS 細(xì)胞系間種種差異的機(jī)制，建立根據(jù)不同目的篩選適合 ES 和 iPS 細(xì)