【文章內(nèi)容簡介】 ET1 酶活并偶聯(lián) H3K4 三甲基化與轉(zhuǎn)錄起始的分子機(jī)制；開展相關(guān)的 SET1 亞復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究，進(jìn)一步探討 SET1 復(fù)合物促使其催化能力由單甲基化向三甲基化轉(zhuǎn)變的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；鑒定并體外重構(gòu) SET1 核心復(fù)合物，以此為基礎(chǔ)對該核心復(fù)合物進(jìn)行結(jié)晶和晶體結(jié)構(gòu)解析； 2) 研究 MOF 復(fù)合物催化 H4K16 乙?；慕Y(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及亞基切換改變 MOF 底物專一性的分子機(jī)制；在 已有工作的基礎(chǔ)上，以蛋白結(jié)晶為目的進(jìn)行 MOFMSL1v1和 MOFMSL1/2/3 的結(jié)構(gòu)域相互作用分析，鑒定出可以結(jié)晶的亞復(fù)合物，以此進(jìn)行相關(guān)結(jié)構(gòu)解析，探討 MOF 復(fù)合物底物專一性改變的分子基礎(chǔ)； 3) 研究 JARID2 與 PRC2 復(fù)合物結(jié)合及拮抗 H3K27 甲基轉(zhuǎn)移酶活力的分子機(jī)制；從結(jié)構(gòu)的角度研究 EZH2 為什么單獨(dú)不表現(xiàn)酶活，而與 SUZ12 或 EED 形成復(fù)合物后 EZH2 甲基轉(zhuǎn)移酶活力被激活至上千倍以上。開展 SUZ12 與 JARID2 肽段的復(fù)合物研究，探討其 JARID2 對 PRC2 的調(diào)控作用，并以此為基礎(chǔ)，與課題 4 合作 ，共同開展相關(guān)小分子藥物抑制劑的篩選與開發(fā)； 4) 研究 DNA 主動去甲基化的機(jī)制及相關(guān)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；研究 AID、 TET1 與甲基化 DNA 底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，研究其識別甲基化 DNA，并完成脫氨反應(yīng)的機(jī)制。研究 AID 與 MBD4 以及 GADD45a 等 DNA 修復(fù)蛋白的相互作用，完成相關(guān)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究，從而揭示 AID 介導(dǎo)的 DNA 主動去甲基化途徑中各分子間的調(diào)控機(jī)制； 5) WICH 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能； WICH 染色質(zhì)重塑復(fù)合物亞基 WSTF 極可能參與了DNA 主動去甲基化途徑中的染色質(zhì)重塑步驟，我們計劃研究 WSTF WAC 結(jié)構(gòu)域和 ATP， H2AX 多肽等底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)；研究 WSTF 的串聯(lián)的讀體結(jié)構(gòu)域“ BAZWAKZPHDBromo”與組蛋白的多價態(tài)識別，以及對核小體底物的識別。 本課題的研究結(jié)果將通過與課題１和２的研究組的全面合作在生化水平和細(xì)胞水平等進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證以確定結(jié)構(gòu)預(yù)測的可靠性，并通過系統(tǒng)集成，建立具有國際一流水平的表觀遺傳調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)信息平臺。得到的復(fù)合物結(jié)構(gòu)將作為課題 4 中小分子化合物設(shè)計、篩選和優(yōu)化的部分工作基礎(chǔ)。 課題 4 新的 表觀遺傳調(diào)控蛋白質(zhì)及相關(guān)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)和基于結(jié)構(gòu)的小分子化合物的設(shè)計、篩選和優(yōu)化 1) 重點(diǎn)解析在課題 1 和 2 研究的基礎(chǔ)上新發(fā)現(xiàn)的重編程因子和特異調(diào)控胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞定向分化的表觀遺傳修飾酶（如我們新發(fā)現(xiàn)的 JMJD5及 PRC2 的新激活因子）及相關(guān)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；解析控制常染色質(zhì)和異染色質(zhì)相互轉(zhuǎn)換的調(diào)控蛋白 CHD1 及我們最近發(fā)現(xiàn)的 鏈接組蛋白 H1 與組蛋白H4N 端功能復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；除此以外，我們還將解析其他幾個與干細(xì)胞分化和重編程相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控蛋白及復(fù)合物（如 JMJD1A、 KAP RBP2與 PRC2 復(fù)合物）的三維結(jié)構(gòu)； 2) 基于課題 3 和課題 4 中的蛋白三維結(jié)構(gòu)信息，針對調(diào)控 H3K27 甲基化和 DNA甲基化的關(guān)鍵蛋白（如 AID 和 PRC2）設(shè)計小分子化合物、進(jìn)行篩選和優(yōu)化；針對參與定向分化的 H3K4 和 H3K9 甲基化調(diào)控蛋白設(shè)計小分子化合物、進(jìn)行篩選和優(yōu)化；針對調(diào)控 iPS 重編程的化合物如 VPA、 Vitamin C 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化；驗(yàn)證小分子化合物在干細(xì)胞定向分化和細(xì)胞重編程中的功能。 本課題在與課題１和２的研究組全面合作的基礎(chǔ)上，不僅將弄清新的表觀遺傳因子的三維結(jié)構(gòu)還將整合以上三個課題的信息完成小分子化合物的設(shè)計、合成、篩選、優(yōu)化以及在干細(xì)胞定向分化和重編程中的功能驗(yàn)證。 總之，本項目的四 個課題的研究內(nèi)容各有 側(cè)重 ，緊緊圍繞與干細(xì)胞定向分化與重編程過程的相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能這一核心問題，設(shè)計了環(huán)環(huán)相扣的總體研究內(nèi)容，研究工作相互有機(jī)銜接，蛋白功能與三維結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系， 既突出重點(diǎn)，又相互促進(jìn)。 課題 4 中的基于蛋白結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物設(shè)計、篩選與優(yōu)化為尋找一條通過非遺傳操作手段來高效誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化和 iPS 重編程提供新的思路與技術(shù)手段。 項目名稱： 不同組織與疾病來源的 iPS 多能性差異及其調(diào)控的分子機(jī)制研究 首席科學(xué)家： Miguel Esteban 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究 院 起止年限： 至 依托部門： 中國科學(xué)院 二、預(yù)期目標(biāo) 總體目標(biāo)： 基于對 iPS更能差異性的認(rèn)識，研究其調(diào)控的分子機(jī)制，解決 iPS應(yīng)用前存在的關(guān)鍵科學(xué)難題，為 iPS的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)并提供新的技術(shù)方法。本項目的完成可為影響我國人民健康的重大疾病的治療提供理論基礎(chǔ)和新的思路。進(jìn)一步提升我國在干細(xì)胞理論研究在國際科學(xué)界的地位。在實(shí)際應(yīng)用方面，可利用基礎(chǔ)理論的研究結(jié)果，設(shè)計出治療疾病的新方法。本項目的完成也可為我國生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展提供理論指導(dǎo)，并產(chǎn)生社會效益和經(jīng)濟(jì) 效益。由于 iPS與其它相關(guān)學(xué)科的密切關(guān)系， iPS的研究和發(fā)展還可指導(dǎo)和應(yīng)用到其它學(xué)科，帶動相關(guān)學(xué)科和相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展。 五年預(yù)期目標(biāo) : iPS細(xì)胞不同來源間的差異研究，繪制出不同來源人 iPS表觀和轉(zhuǎn)錄水平全景圖，為更全面了解和認(rèn)識 iPS細(xì)胞提供基礎(chǔ)。 iPS功能性差異的調(diào)控機(jī)制，并基于此機(jī)制推進(jìn)促進(jìn)項目其它領(lǐng)域發(fā)展。 iPS存在免疫原性問題，并對其進(jìn)行深入研究，為其臨床應(yīng)用提供參考。 iPS細(xì)胞中的突變基因，為 iPS的臨床應(yīng)用克服關(guān)鍵的技術(shù)難題。 iPS方法、基因修復(fù)及造血分化技術(shù)的建立，探索 223。地中海貧血等疾病的治療提供新方案。 SCI收錄論文 6080篇，力爭在 SCI影響因子 20分以上的雜志上發(fā)表論文 2篇。 20項以上。 iPS重編程與免疫研究實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)博士生 20人，碩士生 40人，建立一支優(yōu)秀學(xué)術(shù)人才隊伍。 ，促進(jìn)國內(nèi)外本領(lǐng)域交流，擴(kuò)大本項目在研究領(lǐng)域影響，并及時發(fā)現(xiàn)項目進(jìn)展過程中的問題、采用先進(jìn)技術(shù)促成項目的完成。 三、研究方案 總體思路： 本研究將針對不同來源人 iPS細(xì)胞的異同這一中心問題，通過全基因組甲基化測序，轉(zhuǎn)錄本測序，組蛋白分析等技術(shù)，建立其在表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄水平的全景數(shù)據(jù)庫，通過分析比較，回答不同來源 iPS是否存在差異，這些差異與其來源組織是否有關(guān)系，并解釋其可能的機(jī)理與意義；并關(guān)注解決重編程過程中免疫原性變化這一一直以來都被忽視的問題，通過對整個重編程包括誘導(dǎo)和分化過程中免疫原性變化的分析，全面的闡釋這一問題，并對其機(jī)理進(jìn)行探索；同時嘗試解決疾病 iPS臨床應(yīng)用必須解決的突變基因定點(diǎn)修復(fù)問題，通過 SSO修復(fù)和鋅指核酸酶技術(shù)探索修復(fù) 223。地中海貧血疾病常見突變位點(diǎn)：并結(jié)合分析比較的結(jié)果，為將來 iPS技術(shù)臨床應(yīng)用必須解決的兩個關(guān)鍵問題，如何安全高效獲得 iPS和 iPS的高效定向分化，結(jié)合團(tuán)隊優(yōu)勢，分別探索建立安全高效的人 iPS技術(shù)和 iPS細(xì)胞向造血細(xì)胞的高效定向分化技術(shù)，為最終的臨床治療提供依據(jù)。 技術(shù)路線： 研究創(chuàng)新性： 1 通過不同來源人 iPS表觀和轉(zhuǎn)錄水平的異同比較課題的開展，將首次利用高通量的測序技術(shù)建立不同來源人 iPS的表觀和轉(zhuǎn)錄水平的全景數(shù)據(jù)庫，為整個 iPS乃至干細(xì)胞領(lǐng)域的研究提供全面的數(shù)據(jù)參 考，同時根據(jù)比較分析發(fā)現(xiàn)的差異，尋找其產(chǎn)生和調(diào)控的機(jī)理，將可能為 iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供篩選標(biāo)準(zhǔn)。 2 首次明確提出并證實(shí) iPS存在免疫原性并獲得其發(fā)生的機(jī)制。不同組織與疾病來源的 iPS細(xì)胞在重編程和再分化過程免疫原性全景分析不僅是實(shí)現(xiàn) iPS細(xì)胞移植安全進(jìn)入臨床治療階段所必須解決的重大科學(xué)問題，也是目前國內(nèi)外研究尚未涉及的領(lǐng)域，該方面的研究具有重大的理論創(chuàng)新意義和臨床應(yīng)用價值。此外，基質(zhì)微環(huán)境對 iPS細(xì)胞在重編程和再分化過程的影響以及免疫原性變化的作用同樣是國內(nèi)外 iPS細(xì)胞研究尚未涉及的領(lǐng)域，該方面的研究 不僅為 iPS細(xì)胞移植安全進(jìn)入臨床治療階段提供新思路和新方法，而且其理論方面的突破必將為腫瘤等重大疾病的發(fā)病基質(zhì)和臨床治療提供新的理論依據(jù)。 3 通過對 SSO單鏈寡核苷酸介導(dǎo)的基因修復(fù)技術(shù)的探索，及分別用 SSO修復(fù)和鋅指核酸酶技術(shù)建立 223。地中海貧血疾病常見突變位點(diǎn)修復(fù)技術(shù)，首次提出使用安全性高的 SSO技術(shù)在 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)過程中修復(fù) iPS細(xì)胞的基因突變，為點(diǎn)突變的遺傳疾病治療提供新的治療手段；并借助 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)過程中表觀遺傳學(xué)的改變和iPS細(xì)胞的干細(xì)胞特性提高 SSO的修復(fù)效率和解決 SSO修復(fù)細(xì)胞后的增殖問題； 并為 223。地中海貧血疾病的 iPS臨床治療提供基礎(chǔ)。 4 結(jié)合 iPS細(xì)胞臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題：安全獲得 iPS和高效定向分化，本課題將結(jié)合自身在 iPS技術(shù)方面的優(yōu)勢，改進(jìn)并突破現(xiàn)有非病毒 iPS誘導(dǎo)體系，建立安全高效的人 iPS誘導(dǎo)技術(shù)；首次通過建立造血報告基因 iPS細(xì)胞，建立篩選誘導(dǎo)造血分化化合物和支撐細(xì)胞，利用全新的體系建立全新人 iPS造血分化技術(shù)。 研究特色： 國內(nèi)外對于 iPS研究熱點(diǎn)領(lǐng)域主要有以下幾個方面：對 iPS機(jī)理的研究，細(xì)胞是通過怎樣的過程，如何從成體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?iPS細(xì)胞，這其中有哪些關(guān)鍵問題：對于 iPS技術(shù)改進(jìn)的研究，包括更高效，更安全的重編程技術(shù)：對于 iPS應(yīng)用的研究，主要是利用 iPS技術(shù)進(jìn)行疾病模型研究，為將來的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。而針對不同來源 iPS同異和重編程過程中的免疫原性變化研究，這兩個臨床應(yīng)用必須回答的問題，國際上并無系統(tǒng)研究的報道，申報團(tuán)隊在國內(nèi)最早開始 iPS研究，并在免疫學(xué)和基因定點(diǎn)修復(fù)方面有非常強(qiáng)的實(shí)力，對此問題的深入研究將取得重要的突破性進(jìn)展。 在開展不同來源 iPS表觀和轉(zhuǎn)錄水平全景比較分析的同時，我們的研究從免疫學(xué)的角度對重編程過程中的免疫原性問題進(jìn)行探索并建立新的理論體系。 一方面按照遺傳信息流由 DNAmRNA蛋白質(zhì)的順序，從三個層面來研究表觀遺傳對 iPS細(xì)胞免疫原性改變的影響；另一方面根據(jù)機(jī)體生物行為整體性的特點(diǎn)，從環(huán)境的角度研究基質(zhì)微環(huán)境對 iPS細(xì)胞在重編程和再分化過程的影響以及免疫原性變化的作用，并探索其具體調(diào)控機(jī)制。 國內(nèi)外對基因修復(fù)的研究也非常廣泛，我們將結(jié)合自身在 SSO技術(shù)方面的優(yōu)勢，把 iPS細(xì)胞作為 SSO的修復(fù)對象，借助 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)過程中開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等表觀遺傳學(xué)狀態(tài)的改變提高 SSO的修復(fù)效率，使 iPS細(xì)胞中點(diǎn)突變基因得到安全地修復(fù)，同時嘗試?yán)脟H上近 期報道較多的鋅指核酸酶技術(shù)首次建立 223。地中海貧血疾病常見突變位點(diǎn)的修復(fù)技術(shù)。 雖然國內(nèi)外研究團(tuán)隊對 iPS安全性的改進(jìn)一直在努力，但先有的非病毒誘導(dǎo)體系都存在效率非常低的問題，我們將結(jié)合自身在機(jī)理研究中的發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化組合，建立安全高效的人 iPS誘導(dǎo)方法，并通過建立一個全新的造血報告系統(tǒng)，篩選建立高效的人 iPS向造血細(xì)胞分化平臺，為最終的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 可行性分析： 1 立項依據(jù)充分： 目前對于 iPS重編程的研究主要集中在如何高效建立重編程和重編程的機(jī)理上，雖然 iPS技術(shù)不斷得到改進(jìn)， iPS技術(shù)的安全性 也得到了很大的改善，小鼠iPS也通過四倍體實(shí)驗(yàn)證明了其與胚胎干細(xì)胞的相似性，但人 iPS細(xì)胞在走向臨床應(yīng)用之前，尚有一系列必須得到回答的問題仍未有答案，這就是通過不同方法、不同組織細(xì)胞甚至是不同疾病患者來源獲得的人 iPS細(xì)胞，它們之間是否有區(qū)別，是否帶有來源組織的表觀遺傳記憶？它們與人胚胎干細(xì)胞是否真的非常相似？它們在分化的時候是否因此會有區(qū)別？這種差異性是如何調(diào)控的？其確切的機(jī)制如何 ?對于以上問題的解答，將可能在 iPS重編程機(jī)制研究方面取得重要的突破，為其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 同時 iPS技術(shù)在應(yīng)用到臨床治療之 前，有四個關(guān)鍵問題需要解決：一是 iPS進(jìn)入機(jī)體會遭遇機(jī)體免疫系統(tǒng)對其的識別，即 iPS必然存在免疫原性的問題（這也是以往被領(lǐng)域內(nèi)忽視而最近開始有學(xué)者關(guān)注的問題），該問題會大大影響未來iPS臨床應(yīng)用的效果；第二個關(guān)鍵問題是如何高效安全獲得 iPS細(xì)胞，現(xiàn)有的技術(shù)仍然是高效與安全無法同時達(dá)到；第三個關(guān)鍵問題是得到 iPS細(xì)胞后，如何實(shí)現(xiàn)向所需細(xì)胞的高效定向誘導(dǎo)分化；另一個關(guān)鍵問題是疾病患者來源的 iPS在遺傳基因方面存在的缺陷，在 iPS重編程過程中仍然存在，如何有效修復(fù)這種缺陷，使將來應(yīng)用到體內(nèi)的 iPS來源的細(xì)胞為正常 細(xì)胞，這對于 iPS的應(yīng)用也極為關(guān)鍵。 2 具有良好的工作基礎(chǔ)： 本課題的承擔(dān)實(shí)驗(yàn)室包括中科院再生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，在國內(nèi)最早開展 iPS研究，建立了成熟的人 iPS誘導(dǎo)體系，并已經(jīng)建立多種組織和疾病來源的 iPS細(xì)胞株；具有非常完善的免疫學(xué)研究手段和數(shù)十年的免疫學(xué)研究經(jīng)驗(yàn)；在國內(nèi)最早開始基因定點(diǎn)修復(fù)研究，能夠很好的支撐整個項目的順利實(shí)施。 3 具有有意義的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1） 已經(jīng)完成臍帶來源 iPS細(xì)胞和 H9胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本測序，通過比較分析發(fā)現(xiàn)一系 列差異基因，并發(fā)現(xiàn)這些差異基因很多可能與其組織來源相關(guān)。 2） 已經(jīng)對整個造血系統(tǒng)不同類型細(xì)胞進(jìn)行全面表觀遺傳分析，為本課題的開展提供有利的依據(jù)。 4 承擔(dān)者具有完成項目的能力