【文章內容簡介】 ET1 酶活并偶聯(lián) H3K4 三甲基化與轉錄起始的分子機制；開展相關的 SET1 亞復合物結構研究，進一步探討 SET1 復合物促使其催化能力由單甲基化向三甲基化轉變的結構基礎；鑒定并體外重構 SET1 核心復合物，以此為基礎對該核心復合物進行結晶和晶體結構解析； 2) 研究 MOF 復合物催化 H4K16 乙酰化的結構基礎及亞基切換改變 MOF 底物專一性的分子機制；在 已有工作的基礎上，以蛋白結晶為目的進行 MOFMSL1v1和 MOFMSL1/2/3 的結構域相互作用分析，鑒定出可以結晶的亞復合物，以此進行相關結構解析，探討 MOF 復合物底物專一性改變的分子基礎； 3) 研究 JARID2 與 PRC2 復合物結合及拮抗 H3K27 甲基轉移酶活力的分子機制；從結構的角度研究 EZH2 為什么單獨不表現(xiàn)酶活，而與 SUZ12 或 EED 形成復合物后 EZH2 甲基轉移酶活力被激活至上千倍以上。開展 SUZ12 與 JARID2 肽段的復合物研究，探討其 JARID2 對 PRC2 的調控作用，并以此為基礎，與課題 4 合作 ，共同開展相關小分子藥物抑制劑的篩選與開發(fā)； 4) 研究 DNA 主動去甲基化的機制及相關復合物的結構；研究 AID、 TET1 與甲基化 DNA 底物復合物的結構，研究其識別甲基化 DNA，并完成脫氨反應的機制。研究 AID 與 MBD4 以及 GADD45a 等 DNA 修復蛋白的相互作用，完成相關復合物的結構研究，從而揭示 AID 介導的 DNA 主動去甲基化途徑中各分子間的調控機制； 5) WICH 復合物的結構與功能； WICH 染色質重塑復合物亞基 WSTF 極可能參與了DNA 主動去甲基化途徑中的染色質重塑步驟，我們計劃研究 WSTF WAC 結構域和 ATP， H2AX 多肽等底物的復合物結構；研究 WSTF 的串聯(lián)的讀體結構域“ BAZWAKZPHDBromo”與組蛋白的多價態(tài)識別，以及對核小體底物的識別。 本課題的研究結果將通過與課題１和２的研究組的全面合作在生化水平和細胞水平等進行進一步的功能驗證以確定結構預測的可靠性，并通過系統(tǒng)集成，建立具有國際一流水平的表觀遺傳調控蛋白結構信息平臺。得到的復合物結構將作為課題 4 中小分子化合物設計、篩選和優(yōu)化的部分工作基礎。 課題 4 新的 表觀遺傳調控蛋白質及相關復合物的三維結構和基于結構的小分子化合物的設計、篩選和優(yōu)化 1) 重點解析在課題 1 和 2 研究的基礎上新發(fā)現(xiàn)的重編程因子和特異調控胚胎干細胞向心肌細胞、肝細胞定向分化的表觀遺傳修飾酶（如我們新發(fā)現(xiàn)的 JMJD5及 PRC2 的新激活因子）及相關復合物的三維結構；解析控制常染色質和異染色質相互轉換的調控蛋白 CHD1 及我們最近發(fā)現(xiàn)的 鏈接組蛋白 H1 與組蛋白H4N 端功能復合物的三維結構；除此以外，我們還將解析其他幾個與干細胞分化和重編程相關的表觀遺傳調控蛋白及復合物（如 JMJD1A、 KAP RBP2與 PRC2 復合物）的三維結構； 2) 基于課題 3 和課題 4 中的蛋白三維結構信息，針對調控 H3K27 甲基化和 DNA甲基化的關鍵蛋白（如 AID 和 PRC2）設計小分子化合物、進行篩選和優(yōu)化；針對參與定向分化的 H3K4 和 H3K9 甲基化調控蛋白設計小分子化合物、進行篩選和優(yōu)化；針對調控 iPS 重編程的化合物如 VPA、 Vitamin C 的結構進行優(yōu)化；驗證小分子化合物在干細胞定向分化和細胞重編程中的功能。 本課題在與課題１和２的研究組全面合作的基礎上，不僅將弄清新的表觀遺傳因子的三維結構還將整合以上三個課題的信息完成小分子化合物的設計、合成、篩選、優(yōu)化以及在干細胞定向分化和重編程中的功能驗證。 總之，本項目的四 個課題的研究內容各有 側重 ，緊緊圍繞與干細胞定向分化與重編程過程的相關蛋白的結構與功能這一核心問題，設計了環(huán)環(huán)相扣的總體研究內容，研究工作相互有機銜接，蛋白功能與三維結構緊密聯(lián)系， 既突出重點，又相互促進。 課題 4 中的基于蛋白結構與功能的小分子化合物設計、篩選與優(yōu)化為尋找一條通過非遺傳操作手段來高效誘導干細胞定向分化和 iPS 重編程提供新的思路與技術手段。 項目名稱： 不同組織與疾病來源的 iPS 多能性差異及其調控的分子機制研究 首席科學家： Miguel Esteban 中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究 院 起止年限： 至 依托部門： 中國科學院 二、預期目標 總體目標： 基于對 iPS更能差異性的認識，研究其調控的分子機制，解決 iPS應用前存在的關鍵科學難題，為 iPS的臨床應用奠定理論基礎并提供新的技術方法。本項目的完成可為影響我國人民健康的重大疾病的治療提供理論基礎和新的思路。進一步提升我國在干細胞理論研究在國際科學界的地位。在實際應用方面，可利用基礎理論的研究結果，設計出治療疾病的新方法。本項目的完成也可為我國生物高技術產業(yè)化的發(fā)展提供理論指導，并產生社會效益和經濟 效益。由于 iPS與其它相關學科的密切關系， iPS的研究和發(fā)展還可指導和應用到其它學科，帶動相關學科和相關生物醫(yī)學研究領域的發(fā)展。 五年預期目標 : iPS細胞不同來源間的差異研究，繪制出不同來源人 iPS表觀和轉錄水平全景圖，為更全面了解和認識 iPS細胞提供基礎。 iPS功能性差異的調控機制，并基于此機制推進促進項目其它領域發(fā)展。 iPS存在免疫原性問題，并對其進行深入研究，為其臨床應用提供參考。 iPS細胞中的突變基因，為 iPS的臨床應用克服關鍵的技術難題。 iPS方法、基因修復及造血分化技術的建立，探索 223。地中海貧血等疾病的治療提供新方案。 SCI收錄論文 6080篇，力爭在 SCI影響因子 20分以上的雜志上發(fā)表論文 2篇。 20項以上。 iPS重編程與免疫研究實驗室，培養(yǎng)博士生 20人，碩士生 40人，建立一支優(yōu)秀學術人才隊伍。 ，促進國內外本領域交流，擴大本項目在研究領域影響，并及時發(fā)現(xiàn)項目進展過程中的問題、采用先進技術促成項目的完成。 三、研究方案 總體思路： 本研究將針對不同來源人 iPS細胞的異同這一中心問題，通過全基因組甲基化測序，轉錄本測序，組蛋白分析等技術，建立其在表觀遺傳和轉錄水平的全景數據庫，通過分析比較，回答不同來源 iPS是否存在差異，這些差異與其來源組織是否有關系，并解釋其可能的機理與意義；并關注解決重編程過程中免疫原性變化這一一直以來都被忽視的問題，通過對整個重編程包括誘導和分化過程中免疫原性變化的分析，全面的闡釋這一問題，并對其機理進行探索；同時嘗試解決疾病 iPS臨床應用必須解決的突變基因定點修復問題，通過 SSO修復和鋅指核酸酶技術探索修復 223。地中海貧血疾病常見突變位點：并結合分析比較的結果，為將來 iPS技術臨床應用必須解決的兩個關鍵問題，如何安全高效獲得 iPS和 iPS的高效定向分化，結合團隊優(yōu)勢，分別探索建立安全高效的人 iPS技術和 iPS細胞向造血細胞的高效定向分化技術，為最終的臨床治療提供依據。 技術路線： 研究創(chuàng)新性： 1 通過不同來源人 iPS表觀和轉錄水平的異同比較課題的開展，將首次利用高通量的測序技術建立不同來源人 iPS的表觀和轉錄水平的全景數據庫，為整個 iPS乃至干細胞領域的研究提供全面的數據參 考，同時根據比較分析發(fā)現(xiàn)的差異，尋找其產生和調控的機理，將可能為 iPS細胞的臨床應用提供篩選標準。 2 首次明確提出并證實 iPS存在免疫原性并獲得其發(fā)生的機制。不同組織與疾病來源的 iPS細胞在重編程和再分化過程免疫原性全景分析不僅是實現(xiàn) iPS細胞移植安全進入臨床治療階段所必須解決的重大科學問題，也是目前國內外研究尚未涉及的領域，該方面的研究具有重大的理論創(chuàng)新意義和臨床應用價值。此外，基質微環(huán)境對 iPS細胞在重編程和再分化過程的影響以及免疫原性變化的作用同樣是國內外 iPS細胞研究尚未涉及的領域，該方面的研究 不僅為 iPS細胞移植安全進入臨床治療階段提供新思路和新方法，而且其理論方面的突破必將為腫瘤等重大疾病的發(fā)病基質和臨床治療提供新的理論依據。 3 通過對 SSO單鏈寡核苷酸介導的基因修復技術的探索，及分別用 SSO修復和鋅指核酸酶技術建立 223。地中海貧血疾病常見突變位點修復技術，首次提出使用安全性高的 SSO技術在 iPS細胞誘導過程中修復 iPS細胞的基因突變，為點突變的遺傳疾病治療提供新的治療手段；并借助 iPS細胞誘導過程中表觀遺傳學的改變和iPS細胞的干細胞特性提高 SSO的修復效率和解決 SSO修復細胞后的增殖問題； 并為 223。地中海貧血疾病的 iPS臨床治療提供基礎。 4 結合 iPS細胞臨床應用的關鍵問題：安全獲得 iPS和高效定向分化，本課題將結合自身在 iPS技術方面的優(yōu)勢，改進并突破現(xiàn)有非病毒 iPS誘導體系，建立安全高效的人 iPS誘導技術；首次通過建立造血報告基因 iPS細胞，建立篩選誘導造血分化化合物和支撐細胞，利用全新的體系建立全新人 iPS造血分化技術。 研究特色： 國內外對于 iPS研究熱點領域主要有以下幾個方面：對 iPS機理的研究，細胞是通過怎樣的過程，如何從成體細胞轉變?yōu)?iPS細胞，這其中有哪些關鍵問題：對于 iPS技術改進的研究，包括更高效，更安全的重編程技術：對于 iPS應用的研究，主要是利用 iPS技術進行疾病模型研究，為將來的臨床應用提供基礎。而針對不同來源 iPS同異和重編程過程中的免疫原性變化研究，這兩個臨床應用必須回答的問題，國際上并無系統(tǒng)研究的報道，申報團隊在國內最早開始 iPS研究，并在免疫學和基因定點修復方面有非常強的實力，對此問題的深入研究將取得重要的突破性進展。 在開展不同來源 iPS表觀和轉錄水平全景比較分析的同時，我們的研究從免疫學的角度對重編程過程中的免疫原性問題進行探索并建立新的理論體系。 一方面按照遺傳信息流由 DNAmRNA蛋白質的順序，從三個層面來研究表觀遺傳對 iPS細胞免疫原性改變的影響；另一方面根據機體生物行為整體性的特點，從環(huán)境的角度研究基質微環(huán)境對 iPS細胞在重編程和再分化過程的影響以及免疫原性變化的作用，并探索其具體調控機制。 國內外對基因修復的研究也非常廣泛，我們將結合自身在 SSO技術方面的優(yōu)勢，把 iPS細胞作為 SSO的修復對象，借助 iPS細胞誘導過程中開放的染色質結構等表觀遺傳學狀態(tài)的改變提高 SSO的修復效率，使 iPS細胞中點突變基因得到安全地修復，同時嘗試利用國際上近 期報道較多的鋅指核酸酶技術首次建立 223。地中海貧血疾病常見突變位點的修復技術。 雖然國內外研究團隊對 iPS安全性的改進一直在努力，但先有的非病毒誘導體系都存在效率非常低的問題，我們將結合自身在機理研究中的發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化組合，建立安全高效的人 iPS誘導方法，并通過建立一個全新的造血報告系統(tǒng)，篩選建立高效的人 iPS向造血細胞分化平臺，為最終的臨床應用提供基礎。 可行性分析： 1 立項依據充分： 目前對于 iPS重編程的研究主要集中在如何高效建立重編程和重編程的機理上，雖然 iPS技術不斷得到改進， iPS技術的安全性 也得到了很大的改善，小鼠iPS也通過四倍體實驗證明了其與胚胎干細胞的相似性，但人 iPS細胞在走向臨床應用之前，尚有一系列必須得到回答的問題仍未有答案，這就是通過不同方法、不同組織細胞甚至是不同疾病患者來源獲得的人 iPS細胞，它們之間是否有區(qū)別，是否帶有來源組織的表觀遺傳記憶？它們與人胚胎干細胞是否真的非常相似？它們在分化的時候是否因此會有區(qū)別？這種差異性是如何調控的？其確切的機制如何 ?對于以上問題的解答，將可能在 iPS重編程機制研究方面取得重要的突破，為其應用提供理論基礎。 同時 iPS技術在應用到臨床治療之 前，有四個關鍵問題需要解決：一是 iPS進入機體會遭遇機體免疫系統(tǒng)對其的識別，即 iPS必然存在免疫原性的問題（這也是以往被領域內忽視而最近開始有學者關注的問題），該問題會大大影響未來iPS臨床應用的效果；第二個關鍵問題是如何高效安全獲得 iPS細胞，現(xiàn)有的技術仍然是高效與安全無法同時達到；第三個關鍵問題是得到 iPS細胞后，如何實現(xiàn)向所需細胞的高效定向誘導分化；另一個關鍵問題是疾病患者來源的 iPS在遺傳基因方面存在的缺陷，在 iPS重編程過程中仍然存在，如何有效修復這種缺陷，使將來應用到體內的 iPS來源的細胞為正常 細胞，這對于 iPS的應用也極為關鍵。 2 具有良好的工作基礎： 本課題的承擔實驗室包括中科院再生生物學重點實驗室、醫(yī)學免疫學國家重點實驗室和醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，在國內最早開展 iPS研究，建立了成熟的人 iPS誘導體系，并已經建立多種組織和疾病來源的 iPS細胞株；具有非常完善的免疫學研究手段和數十年的免疫學研究經驗；在國內最早開始基因定點修復研究，能夠很好的支撐整個項目的順利實施。 3 具有有意義的預實驗結果： 1） 已經完成臍帶來源 iPS細胞和 H9胚胎干細胞的轉錄本測序，通過比較分析發(fā)現(xiàn)一系 列差異基因，并發(fā)現(xiàn)這些差異基因很多可能與其組織來源相關。 2） 已經對整個造血系統(tǒng)不同類型細胞進行全面表觀遺傳分析，為本課題的開展提供有利的依據。 4 承擔者具有完成項目的能力