【正文】 項目名稱： 人多能干細(xì)胞多能性維持和發(fā)育潛能差異的系統(tǒng)研究 首席科學(xué)家： 康九紅 同濟(jì)大學(xué) 起止年限： 至 依托部門： 教育部 上海市科委 二、預(yù)期目標(biāo) 總體目標(biāo)： 本項目以不同來源的 ES 和 iPS 細(xì)胞系為研究對象 ，以探索其多能性及穩(wěn)定維持、向特定譜系分化的潛能、臨床有效性及安全性差異的分子機(jī)制，并通過比較研究差異，建立 ES 和 iPS 細(xì)胞系在臨床應(yīng)用中的標(biāo)準(zhǔn)和根據(jù)不同目的篩選 ES和 iPS 細(xì)胞系的便捷方法為總體目標(biāo)。血液系統(tǒng)遺傳疾病可能是 iPS臨床移植治療能夠被最先應(yīng)用的領(lǐng)域，本課題將在探索利用單鏈寡核苷酸介導(dǎo)的靶向性基因定點修復(fù)技術(shù)的同時，利用 SSO 修復(fù)和鋅指核酸酶技術(shù)，分別探索建立 223。 4. iPS 技術(shù)最終要應(yīng)用到臨床，有兩個關(guān)鍵技術(shù)問題必須解決，一個是如何安全高效的獲得 iPS 細(xì)胞，另一個是如何將 iPS 細(xì)胞安全高效的定向誘導(dǎo)為為所需的細(xì)胞。本項目所針對的下述關(guān)鍵科學(xué)問題的解決也將可能為 iPS 的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 3 成功增殖和誘導(dǎo)分化修復(fù)后疾病來源的 iPS細(xì)胞。 3 SSO修復(fù)后，對 iPS的多能性和靶向性修復(fù)進(jìn)行不同層次的鑒定。 6 得出檢測鋅指核酸酶的修復(fù)突變效率，與 SSO介導(dǎo)的修復(fù)效率比較優(yōu)劣。 預(yù)期目標(biāo)： 1 初步建立不同來源 iPS全景網(wǎng)絡(luò)圖。 2 利用已建株的基質(zhì)細(xì)胞模擬基質(zhì)微環(huán)境，研究基質(zhì)微環(huán)境存在與否對 iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響，并通過已有的研究平臺檢測基質(zhì)微環(huán)境對 iPS細(xì) 胞免疫原性，致瘤率以及再分化的影響，并深入研究其相關(guān)機(jī)制； 3 取具有點突變 mGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細(xì)胞，在誘導(dǎo)過程中加入 SSO修復(fù)突變基因，觀察修復(fù)后 iPS細(xì)胞的增殖情況，在上述工作的基礎(chǔ)上嘗試修復(fù)疾病來源的 iPS細(xì)胞中的突變基因。 6 進(jìn)一步優(yōu)化穩(wěn)定高效的非病毒 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng) 7 利用帶有報告基因的 iPS或胚胎干細(xì)胞系以及篩選獲得高效支持細(xì)胞（骨髓細(xì)胞）共培養(yǎng)，通過加入造血相關(guān)的各因子誘導(dǎo)造血分化， 預(yù)期目標(biāo)： 1 分析得到關(guān)鍵因子 5~10個進(jìn)行 深入研究其作用機(jī)理 2 篩選出誘導(dǎo)機(jī)體不同的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 iPS細(xì)胞安全和高效的優(yōu)化方案。 2 結(jié)合項目總體進(jìn)展，補(bǔ)充部分必要 iPS細(xì)胞數(shù)據(jù)。 5 得到含有突變類型報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過 PCR等技術(shù)對構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行鑒定。 6 利用已經(jīng)成功建立的化合物等優(yōu)化非病毒 iPS系統(tǒng)誘導(dǎo)獲得 iPS細(xì)胞 7 過鋅指蛋白酶技術(shù)，構(gòu)建帶有造血發(fā)育標(biāo)記并可進(jìn)行動態(tài)觀測分化的 iPS細(xì)胞系。 7 獲得非病毒系統(tǒng) iPS細(xì)胞并收集獲取不同時期的骨髓細(xì)胞以備后期建立造血分化平臺。 3 建立小鼠和人不同免疫細(xì)胞來源地 iPS細(xì)胞庫。 6 優(yōu)化附加體基因?qū)胂到y(tǒng)，開發(fā)新的蛋白遞送肽，同時篩選像 Vc一樣具有提高 iPS誘導(dǎo)效率的小分子化合物。 2 利用流式分選儀器分別純化小鼠和人的各種免疫細(xì)胞群，分別誘導(dǎo)制備不同成體細(xì)胞來源的 iPS細(xì)胞。 利用造血報告細(xì)胞系篩選高效支持細(xì)胞 分離不同時期流產(chǎn)胎兒骨髓細(xì)胞，利用帶有報告基因 iPS或胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)，篩選出能高效誘導(dǎo)造血分化的支持細(xì)胞系。 2 建立高效人 iPS造血分化技術(shù)。本研究將開發(fā)新的一 系列蛋白遞送肽來提高iPS的效率。 附加體質(zhì)?？梢栽谡婧思?xì)胞中復(fù)制，并且其非整合特性預(yù)示著它將是安全的誘導(dǎo)系統(tǒng)之一。 經(jīng)費(fèi)比例： 20% 承擔(dān)單位： 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基 礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院 課題負(fù)責(zé)人： 黃粵 學(xué)術(shù)骨干： 呂湘、李峰、董文吉、陳峰 課題 4 ： 基于多能性差異機(jī)制的安全高效重編程及造血細(xì)胞定向分化新技術(shù)探索 研究目標(biāo)： 改進(jìn)非病毒體系人 iPS誘導(dǎo)技術(shù)，結(jié)合附加體、蛋白及小分子化合物，探索出安全高效誘導(dǎo)體系；通過建立帶造血報告基因 iPS細(xì)胞系，篩選不同促進(jìn)造血分化化合物及支撐細(xì)胞，建立高效造血分化新技術(shù)，為 iPS技術(shù)最終臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 iPS單克隆，然后通過 PCR測序方法和突變檢測試劑盒篩選鑒定已經(jīng)糾正的 iPS細(xì)胞克隆。利用 PCR方法擴(kuò)增得到不含任何突變的 beta珠蛋白基因供體 DNA（ donor DNA）片段，并將該 DNA片段插入到 T載體，得到的 TDonorDNA質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。轉(zhuǎn)染鋅指核酸酶表達(dá)質(zhì)粒和供體質(zhì)粒到含有突變位點的穩(wěn)定細(xì)胞株，通過觀察和流式分析綠色熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞的比例即可判定鋅指核酸酶的有效性，通過分析細(xì)胞凋亡的比例即可判定鋅指核酸酶作用的特異性和細(xì)胞毒性。 4 在上述工作的基礎(chǔ)上嘗試修復(fù)疾病來源的 iPS細(xì)胞中的突變基因，例如修復(fù)地中海貧血患者來源的 iPS細(xì)胞中的基因突變，并嘗試對修復(fù)后細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)分化。在誘導(dǎo)過程中加入 SSO，在重編程的過程中用 SSO更為有效得修復(fù) EGFP的突變位 點，并進(jìn)一步對 iPS的形成和靶向性修復(fù)進(jìn)行不同層次的鑒定。地中海貧血 iPS常見突變位點修復(fù) 建立哺乳動物細(xì)胞熒光報告系統(tǒng)： 構(gòu)建了帶有突變的 EGFP質(zhì)粒載體（ mEGFP），該載體模擬了地中海貧血基因突變類型中的起始密碼突 變，將 EGFP的啟動子 ATG突變?yōu)?TTG，因此不能表達(dá)綠色熒光蛋白。 5 研究腫瘤基質(zhì)微環(huán)境對 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)和再分化的影響，探索腫瘤干細(xì)胞的形成與腫瘤基質(zhì)微環(huán)境的相關(guān)性：建立腫瘤基質(zhì)微環(huán)境體外研究平臺，研究其對對 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)和再分化的影響，并在此基礎(chǔ)上建立腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生的模擬體系，探索腫瘤形成的細(xì)胞機(jī)制，為腫瘤病因?qū)W研究和腫瘤治療奠定基礎(chǔ)。設(shè)計不同的體內(nèi)和體外實驗環(huán)境誘導(dǎo) iPS細(xì)胞再分化。 利用不同抗體，用免疫共沉淀技術(shù)將不同組蛋白修飾的 DNA片段拉下來，利用 Solexa測序儀進(jìn)行測序。將獲得的 cDNA利用 Solexa測序儀進(jìn)行測序。對尋找到的關(guān)鍵基因進(jìn)行重硫酸鹽測序法驗證。 研究內(nèi)容： 1 對不同來源 iPS及其來源細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞全基因組甲基化分析。通過這四個課題的緊密有機(jī)合作為點突變遺傳病患者的治療提供新的治療手段。對于基因突變的遺傳性疾病，如果應(yīng)用 iPS治療，就要取其自身來源的體細(xì)胞誘導(dǎo)成為 iPS，該細(xì)胞中仍然存在基因突變，這個突變的基因位點在治療前必須被修復(fù)。課題參加單位第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所均為國家重點實驗室，具備完成本項目課題的條件。目前本依托單位十分重視本項目的申請和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（ iPS）技術(shù)的疾病模型與機(jī)理研究方面的相關(guān)研究，并已提供了很好的前期工作條件，包括場地、設(shè)備、人員和經(jīng)費(fèi)支持等。 2） 已經(jīng)對整個造血系統(tǒng)不同類型細(xì)胞進(jìn)行全面表觀遺傳分析，為本課題的開展提供有利的依據(jù)。 可行性分析： 1 立項依據(jù)充分： 目前對于 iPS重編程的研究主要集中在如何高效建立重編程和重編程的機(jī)理上，雖然 iPS技術(shù)不斷得到改進(jìn)， iPS技術(shù)的安全性 也得到了很大的改善，小鼠iPS也通過四倍體實驗證明了其與胚胎干細(xì)胞的相似性，但人 iPS細(xì)胞在走向臨床應(yīng)用之前，尚有一系列必須得到回答的問題仍未有答案，這就是通過不同方法、不同組織細(xì)胞甚至是不同疾病患者來源獲得的人 iPS細(xì)胞，它們之間是否有區(qū)別，是否帶有來源組織的表觀遺傳記憶？它們與人胚胎干細(xì)胞是否真的非常相似？它們在分化的時候是否因此會有區(qū)別？這種差異性是如何調(diào)控的？其確切的機(jī)制如何 ?對于以上問題的解答，將可能在 iPS重編程機(jī)制研究方面取得重要的突破，為其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 一方面按照遺傳信息流由 DNAmRNA蛋白質(zhì)的順序，從三個層面來研究表觀遺傳對 iPS細(xì)胞免疫原性改變的影響；另一方面根據(jù)機(jī)體生物行為整體性的特點，從環(huán)境的角度研究基質(zhì)微環(huán)境對 iPS細(xì)胞在重編程和再分化過程的影響以及免疫原性變化的作用，并探索其具體調(diào)控機(jī)制。 4 結(jié)合 iPS細(xì)胞臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題：安全獲得 iPS和高效定向分化，本課題將結(jié)合自身在 iPS技術(shù)方面的優(yōu)勢，改進(jìn)并突破現(xiàn)有非病毒 iPS誘導(dǎo)體系，建立安全高效的人 iPS誘導(dǎo)技術(shù)；首次通過建立造血報告基因 iPS細(xì)胞，建立篩選誘導(dǎo)造血分化化合物和支撐細(xì)胞，利用全新的體系建立全新人 iPS造血分化技術(shù)。此外，基質(zhì)微環(huán)境對 iPS細(xì)胞在重編程和再分化過程的影響以及免疫原性變化的作用同樣是國內(nèi)外 iPS細(xì)胞研究尚未涉及的領(lǐng)域，該方面的研究 不僅為 iPS細(xì)胞移植安全進(jìn)入臨床治療階段提供新思路和新方法，而且其理論方面的突破必將為腫瘤等重大疾病的發(fā)病基質(zhì)和臨床治療提供新的理論依據(jù)。地中海貧血疾病常見突變位點：并結(jié)合分析比較的結(jié)果，為將來 iPS技術(shù)臨床應(yīng)用必須解決的兩個關(guān)鍵問題，如何安全高效獲得 iPS和 iPS的高效定向分化，結(jié)合團(tuán)隊優(yōu)勢，分別探索建立安全高效的人 iPS技術(shù)和 iPS細(xì)胞向造血細(xì)胞的高效定向分化技術(shù)，為最終的臨床治療提供依據(jù)。 20項以上。 iPS細(xì)胞中的突變基因，為 iPS的臨床應(yīng)用克服關(guān)鍵的技術(shù)難題。由于 iPS與其它相關(guān)學(xué)科的密切關(guān)系， iPS的研究和發(fā)展還可指導(dǎo)和應(yīng)用到其它學(xué)科，帶動相關(guān)學(xué)科和相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展。本項目的完成可為影響我國人民健康的重大疾病的治療提供理論基礎(chǔ)和新的思路。 本課題在與課題１和２的研究組全面合作的基礎(chǔ)上，不僅將弄清新的表觀遺傳因子的三維結(jié)構(gòu)還將整合以上三個課題的信息完成小分子化合物的設(shè)計、合成、篩選、優(yōu)化以及在干細(xì)胞定向分化和重編程中的功能驗證。研究 AID 與 MBD4 以及 GADD45a 等 DNA 修復(fù)蛋白的相互作用，完成相關(guān)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究，從而揭示 AID 介導(dǎo)的 DNA 主動去甲基化途徑中各分子間的調(diào)控機(jī)制； 5) WICH 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能； WICH 染色質(zhì)重塑復(fù)合物亞基 WSTF 極可能參與了DNA 主動去甲基化途徑中的染色質(zhì)重塑步驟，我們計劃研究 WSTF WAC 結(jié)構(gòu)域和 ATP， H2AX 多肽等底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)；研究 WSTF 的串聯(lián)的讀體結(jié)構(gòu)域“ BAZWAKZPHDBromo”與組蛋白的多價態(tài)識別，以及對核小體底物的識別。 課題３ 干細(xì)胞定向分化和重編程中調(diào)控組蛋白修飾、 DNA 甲基化相關(guān)蛋白質(zhì)及復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)解析 重點解析調(diào)控干細(xì)胞定向分化和重編程中涉及的組蛋白 H3K4 甲基化、 H3K9甲基化、 H3K27 甲基化和 H4K16 乙酰化修飾、 DNA 甲基化修飾調(diào)控的酶和相關(guān)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。 課題１ 干細(xì)胞向心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞定向分化與重編程中 重要的和新的 表觀遺傳蛋白及復(fù)合物的篩選與功能研究 1) 在已有的工作基礎(chǔ)上，研究參與胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞定向分化過程中表觀遺傳調(diào)控蛋白的功能；利用小干擾 RNA 的方法，篩選參與 胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞定向分化的新組蛋白修飾酶、 DNA 甲基化修飾酶、染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)調(diào)控蛋白、核小體組裝和去組裝蛋白；篩選參與胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞定向分化的 miRNA 及調(diào)控這些 miRNA 的表觀遺傳調(diào)控酶及復(fù)合物；利用 RNAi 和 /或過表達(dá)的方法研究哪些表觀遺傳調(diào)控蛋白或復(fù)合物可提高胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞定向分化的效率； 2) 利用小鼠 /大鼠疾病模型，將在體外胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的 心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞進(jìn)行移植 ，評估分化的細(xì)胞在動物體內(nèi)的功能以及在動物個體發(fā)育水平和動物疾病模型中的有效性和安全性； 3) 利 用 2D 與蛋白質(zhì)譜的技術(shù)分離卵母細(xì)胞激活中參與調(diào)控重編程的蛋白；研究參與重編程的重要表觀遺傳調(diào)控蛋白及復(fù)合物及在 iPS 細(xì)胞重編程中的功能；弄清這些重要表觀遺傳調(diào)控蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 結(jié)題總結(jié) 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 要作用的蛋白； 5） 進(jìn)行項目總結(jié)，論文書寫。 2） 完成干細(xì)胞定向分化與重編程的表觀遺傳調(diào)控規(guī)律與調(diào)控因子的篩選與機(jī)制研究 。 化合物探針探尋到新的靶標(biāo)蛋白并開展結(jié)構(gòu)和功能的化學(xué)生物學(xué)研究。 4） 研究表觀遺傳修飾酶和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，尋找干細(xì)胞向心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞定向分化和重編程的關(guān)鍵因子及其作用 。 2） 完成干細(xì)胞定向分化過程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和表觀遺 傳修飾的變化規(guī)律研究 。通過復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究表觀遺傳修飾酶和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換蛋白復(fù)合物的分子機(jī)理和底物識別機(jī)理；爭取篩選出功能類似或優(yōu)于先導(dǎo)化合物的小分子。 4） 篩選 復(fù)合物 晶體 的 生長條件， 研究底物和蛋白質(zhì)的結(jié)合性質(zhì) ；利用合成出的小分子化合物開展篩選工作；將已知的活性小分子化合物作為分子探針，開展化學(xué)生物學(xué)工作來探明在 iPS的重編程及定向分化過程中起重要作用的蛋白；進(jìn)一步深入開展基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的小分子化合物計算機(jī)輔助設(shè)計和化學(xué)合成工作。對得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和功能分析，撰寫論文； 4） 優(yōu)化出 最優(yōu)的晶體生長條件 ，收集蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，解出 24個蛋白的結(jié)構(gòu)；合成出一系列基于先導(dǎo)化合物的小分子；合成出幾個特定的小分子化合物探針；設(shè)計并合成一系列基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的小分子底物。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 合物作為分子探針，探明在 iPS重編程及定向分化中起重要作用的蛋白。 3） 系統(tǒng)開展在干細(xì)胞定向分化和重編程過程中調(diào)控 H3K4甲基化、 H3K27甲基化、 H4K16