【正文】 （六） 其它應(yīng)考核的指標(biāo) 本課題集中了 生殖醫(yī)學(xué)、 免疫學(xué)、分析化學(xué)、 毒理學(xué)、藥學(xué)等 相關(guān) 學(xué)科 ，有利于這些學(xué)科的交叉與融合；同時(shí)與企業(yè)的合作，有利于理論與實(shí)際的聯(lián)系 ，對(duì)學(xué)科的發(fā)展起著積極的推動(dòng)作用 。在總結(jié)經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)國(guó)家計(jì)劃生育網(wǎng)絡(luò)逐步將產(chǎn)品推向全國(guó)。 本產(chǎn)品屬高科技綠色環(huán)保產(chǎn)品，對(duì)環(huán)境不會(huì)產(chǎn)生任何影響。男性避孕方法的發(fā)展和應(yīng)用，已使夫婦在計(jì)劃生育上增加了一個(gè)自由選擇的重要空間，有利于人們的生殖健康。本產(chǎn)品的研制首先立足于國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，特別是已婚已生育的男性 ，估計(jì)可使用人群至少超過(guò) 1 億，因而具有極大的市場(chǎng)開發(fā)前景；同時(shí)將出口到其他人口大國(guó)如印度、巴西等，同時(shí)申報(bào)國(guó)際專利。 2． 預(yù)期目標(biāo) 1）開發(fā)出 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白疫苗，并提 供其完整的非臨床研究資料； 2）揭示 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白疫苗的抗生育靶標(biāo)及其作用機(jī)制； 3）建立合適的男性避孕疫苗非臨床研究的評(píng)價(jià)體系； 4）申報(bào)國(guó)家發(fā)明專利 46 項(xiàng)，發(fā)表和接受高質(zhì)量 SCI 收錄論文 1520 篇，出版專題報(bào)告或相應(yīng)的學(xué)術(shù)專著 12 部。 疫苗的局部刺激性、過(guò)敏性和溶血性試驗(yàn) 以兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)下列指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)： 1）局部刺激性試驗(yàn)：包括皮膚刺激性試驗(yàn)、注射給藥部位的刺激性試驗(yàn)、眼刺激性試驗(yàn)等； 2）過(guò)敏性試驗(yàn)： A，經(jīng)皮給藥過(guò)敏性試驗(yàn)，考察皮膚過(guò)敏性反應(yīng)，采用 BT 或 GPMT 或其他合理的試驗(yàn)方法 B，注射給藥過(guò)敏性試驗(yàn)，采用 ASA 和 PCA 或其他合理的方法考察全身過(guò)敏性反應(yīng) 3）溶血性試驗(yàn)：常規(guī)的體外試管法（肉眼觀察法） 疫苗的 IIII 段生殖毒性試驗(yàn) （按《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》第二稿進(jìn)行） 以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行下列三段生殖毒性評(píng)價(jià)： 1）生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)（ I 段） A，從交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的發(fā)育和成熟、交配行為、受精） B，從受孕到著床（成年雌性生殖功能、著床前發(fā)育、著床） 2）胚胎 胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)（ II 段） 21 C，從著床到硬腭閉合（成年雌性生殖功能、胚胎發(fā)育、主要器官形成） D，從硬腭閉合到妊娠終止（成年雌性生殖功能、胎仔發(fā)育與生長(zhǎng)、器官發(fā)育和生長(zhǎng)） 3）圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)（ III 段） E，從出生到離乳（成年雌性生殖功能、幼子對(duì)宮外生活的適應(yīng)性、離乳前發(fā)育和生長(zhǎng)） F，從離乳到性成熟（離乳后發(fā)育和生長(zhǎng)、獨(dú)立生活的適應(yīng)能力、達(dá)到性成熟的情況） 疫苗的致突變?cè)囼?yàn)、致癌試驗(yàn)（必要時(shí)） 1）致突變?cè)囼?yàn) A，微生物回突變（ Ames）試驗(yàn) B，哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞（ CHL）染色體畸形試驗(yàn) C，嚙齒動(dòng)物（ NIH 小鼠）微核試驗(yàn) D，小鼠顯形致死試驗(yàn)（ DLT） 2）致癌試驗(yàn)（必要時(shí)） A，體外短期篩選試驗(yàn)，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn) B，哺乳動(dòng)物短期致癌試驗(yàn)（有限體內(nèi)致癌試驗(yàn)），如小鼠皮膚 腫瘤誘發(fā)試驗(yàn)、小鼠肺瘤誘發(fā)試驗(yàn)、大鼠肝轉(zhuǎn)化灶誘發(fā)試驗(yàn)、雌性大鼠乳腺癌誘發(fā)試驗(yàn)等 C，長(zhǎng)期致癌試驗(yàn)：大鼠的終 身 致癌試驗(yàn)。 Eppin 蛋白疫苗的抗生育靶標(biāo)及其機(jī)制 研究 1）系統(tǒng)研究 Eppin 蛋白結(jié)構(gòu)，尋找 Eppin 抗體在 Eppin 的抗原決定表位； 2）運(yùn)用原代分離的生精上皮或細(xì)胞株，運(yùn)用免疫組化方法研究 Eppin 蛋白抗體與細(xì)胞表面 Eppin 蛋白的結(jié)合情況； 3） Eppin 蛋白抗體的結(jié)合靶點(diǎn)：運(yùn)用放射示蹤法或免疫組化法，分析動(dòng)物免疫后，抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)在精子發(fā)生的過(guò)程中的遷移、變化情況； 4） Eppin 抗體引起的異常精液凝固液化機(jī)制：通過(guò)分析 Eppin 蛋白被抗體封閉后， 前列腺特異性抗原（ PSA）酶活性的變化、 Sg 片段的檢測(cè)等，分析對(duì)精液液化、精子獲能與運(yùn)動(dòng)的影響； 5） Eppin 對(duì) PSA 酶活性影響的位點(diǎn)：通過(guò)基因突變技術(shù)，突變某些基因位點(diǎn)，分析 PSA酶活性變化及其 Eppin 對(duì) PSA 酶活力的影響； 6）進(jìn)一步研究 Eppin 蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，深入探討 Eppin 抗體抗生育的分子機(jī)制。 4） FSHR 多肽疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗生育機(jī)制 A，運(yùn)用已標(biāo)記的 FSHR 多肽抗體被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察抗體在睪丸組織中的分布、結(jié)合的靶點(diǎn)； B，研究動(dòng)物免疫后，精子發(fā)生的主要階段（精原細(xì)胞 精母細(xì)胞 精子細(xì)胞 精子）細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的影響，尋找影響的關(guān)鍵環(huán)節(jié)； C，研究動(dòng)物免疫后，對(duì)支持細(xì) 胞和間質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的影響； 研究相關(guān)指標(biāo) ： 成年雄性冠毛獼猴免疫接種 FSHR 多肽疫苗后血清雄激素的濃度沒有明顯改變，山羊 FSHR 多肽疫苗接種組的血清雄激素水平低于對(duì)照組。 FSHR 多肽疫苗的抗生育靶標(biāo)及其非臨床機(jī)制研究 1） FSHR 多肽的體外 結(jié)合試驗(yàn) 選擇特異表達(dá) FSHR 的睪丸 sertoli 細(xì)胞，分為四組，分別是一般培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)染空噬菌體（對(duì)照組 ） ，另三組細(xì)胞特異性阻斷 FSHR 基因的表達(dá) (實(shí)驗(yàn)組 )，分別轉(zhuǎn)染第 33 位、35 位和 37 位氨基酸突變的多肽，加入 FSH（同位素標(biāo)記 FSH 與單純 FSH） 與細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 FSH 與 sertoli 細(xì)胞的結(jié)合 。 3）抗生育研究 ① 對(duì)雄性動(dòng)物生殖機(jī)能的影響 18 A，對(duì)精子發(fā)生的影響：結(jié)合抗體產(chǎn)生的情況，分析免疫后不同階段精子細(xì)胞的數(shù)量、實(shí)時(shí)計(jì)數(shù)精子的數(shù)量 B，對(duì)精液質(zhì)量的影響：主要針對(duì) Eppin 蛋白，精液的理化特性、精液的液化、精子的運(yùn)動(dòng)能力等 C，對(duì)性激素分泌的影響：分析免疫后，血液和睪丸組織中 FSH、 LH、 T、 GnRH 等激素的變化 D，對(duì)性欲（性功能）的影響：觀察免疫后雄性動(dòng)物的交配能力 ② 雌性動(dòng)物的受孕狀況：動(dòng)物免疫后，于抗體滴度達(dá)到有效水平時(shí)，按 1： 1 比例與雌性動(dòng)物交配，觀察雌性動(dòng)物的受孕情況、妊娠過(guò)程以及妊娠結(jié)局等。 3）藥代動(dòng)力學(xué)研究 在上述兩部分研究的同時(shí)，分析血液中 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白的含量。 B．抗體檢測(cè)：于免疫前、免疫后第 1 周起，每 2 周采集動(dòng)物血液，運(yùn)用 ELISA 法分析血液中抗體的水平；分析免疫后，抗體發(fā)生的動(dòng)態(tài)曲線。并適時(shí)檢測(cè)精液中抗體的滴度，分析與血液中抗體的相關(guān)性；比較不同免疫途徑時(shí)，抗體產(chǎn)生的效率。將 100 ug重組 Eppin 蛋白溶解在 ml PBS 中（ pH ），再加入 ml 4:1 含量的 Squalene:Arlacel A溶劑或 Freund 完全佐劑（ CFA）制成 Eppin 蛋白疫苗。 根據(jù)前期研究的初步結(jié)果，應(yīng)用上述三 16 種多肽的混合物制成的疫苗抗生育效果 最強(qiáng) 。本課題組 所在部門 系 省部共建 “ 人類生殖調(diào)控與危害評(píng)估 ” 國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)、省部共建教育部 “ 現(xiàn)代毒理學(xué) ” 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及江蘇省應(yīng)用毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、江蘇省 “ 醫(yī)藥、農(nóng)藥、獸藥 ” 安全性評(píng)價(jià)與研究（ GLP）中心、國(guó)家避孕藥具不良反應(yīng)監(jiān)測(cè) 與防治研究 中心（籌）等，為 本 項(xiàng)目的順利實(shí)施提供了可靠的物質(zhì)保證。本課題組多年來(lái)建立的避孕藥具不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)也可為本課題 研究 提供有力的支持。 本課題組具備項(xiàng)目研究所 需的各種技術(shù)，并將借鑒其它已開發(fā)成功的疫苗的研究方法 ，并將提出 FSHR多肽 疫苗 和 Eppin蛋白疫苗 的有關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。 有鑒于 FSHR多肽和 Eppin 蛋白疫苗 的 作用環(huán)節(jié) 分別是阻斷精子發(fā)生、成熟 及精卵結(jié)合，因而其聯(lián)合使用有望形成功能互補(bǔ)、增效的 作用，這對(duì)于減少疫苗的使用量、降低毒副效應(yīng)不失為一種有效的 方 法 。為明確 Eppin 的免疫避孕作用， O39。雖然至今尚沒有一種直接作用于附睪并可供臨床試驗(yàn)用的男性避孕藥 ,但對(duì)附睪功能和精子在附睪成熟的研究表明 ,附睪極有可能成為男性抗生育最理想的靶器官。 Remy 的研究發(fā)現(xiàn)， FSHR 的特異性片段位于第 1838位氨基酸 [15]，運(yùn)用噬菌體表達(dá)手段重組抗原對(duì) 4 只成年雄猴進(jìn)行研究 [16]。此受體存在于人和動(dòng)物睪丸的支持細(xì)胞、卵泡 顆粒細(xì)胞，通過(guò)介導(dǎo) FSH 的信號(hào)影響雄性青春期生精的啟動(dòng)、成年期生精過(guò)程的維持及雌性卵細(xì)胞各階段的發(fā)育。但到目前為止，還沒有任何一個(gè)單一的抗原能引起小鼠 100%的生育力下降 。但在男性避孕方面 的研究和開發(fā)相對(duì)滯后，至今尚未見可以應(yīng)用的男性避孕疫苗。非激素類避孕主要包括外用殺精子劑、中草藥類避孕藥和免疫避孕疫苗。雖然近年來(lái)男性避孕藥具的研制不斷取得進(jìn)展，但和女性相比，男性避孕方法仍面臨著 “ 可靠方法不可逆，可逆方法不可靠 ” 的尷尬局面，至今尚沒有一種真正可用于臨床的安全、長(zhǎng)效、可逆的方法問世，并且在