【正文】 用量、降低毒副效應(yīng)不失為一種有效的 方 法 。 二、課題的目標(biāo)與任務(wù) 1．項目確定的課題目標(biāo)與任務(wù)需求分析 1）項目確定的課題目標(biāo) （ 1）開發(fā)出 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白疫苗，并提供其完整的非臨床研究資料； （ 2）揭示 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白疫苗的抗生育靶標(biāo)及其作用機(jī)制； （ 3）建立合適的男性避孕疫苗非臨床研究的評價體系； 2） 任務(wù)需求分析 隨著我國和世界人口規(guī)模的不斷擴(kuò)大，積極采取安全、有效避孕節(jié)育措施以控制人口數(shù)量、提高人口質(zhì)量及全民健康水平已迫在眉睫， “ 避孕節(jié)育 ” 研究已成為生殖健康領(lǐng)域“ 十 大挑戰(zhàn) ” 之一。 由于 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白疫苗各自的作用機(jī)制不同，其聯(lián)合使用可能達(dá)到增強(qiáng)避孕效果、降低副作用的目的，不失為男性避孕方法的新的嘗試。 FSHR 多肽 系運用 噬菌體 系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，干擾其純度的主要物質(zhì)為 噬菌體 蛋白，根據(jù)以往同類疫苗的研究結(jié)果，若在表達(dá)后用紫外線對其滅火，一般不會對疫苗產(chǎn)生影響； 為保險起見， 在上述研制的基礎(chǔ)上，擬采用 層析分離法純化 FSHR 多肽 ，并對其含量進(jìn)行鑒定；此外，擬采用 體外化學(xué)合成多肽 的方法合成 FSHR 多肽 。 干擾其純度的物質(zhì)主要為細(xì)胞雜蛋白， 可通過免疫吸附或免疫沉淀的方法純化 Eppin 蛋白 ，可得到高純度的該蛋白。 2）疫苗的免疫原性 研究 疫苗的免疫原性 研究是本項目的關(guān)鍵內(nèi)容，通過該部分的研究，可以為有效性和安全性研究提供準(zhǔn)確的使用劑量、免疫方法和程序；還可在該部分研究中，初步觀察到是否有效、有無副作用以及主要的毒性效應(yīng)，為優(yōu)化后兩部分的研究提供重要參考。 3）疫苗的抗生育靶標(biāo)及其機(jī)制 在 既往研究的基礎(chǔ)上，通過與法國農(nóng)科院和美國北卡大學(xué)的繼續(xù)合作，對這 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白的機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)、深入地研究，有望有突破性地發(fā)現(xiàn)，為疫苗的進(jìn)一步優(yōu)化提供重要依據(jù)。與此形成鮮明對 照 的是男性避孕方法還局限于傳統(tǒng)的體外排精、絕育術(shù)和使用避孕套等。激素類避孕方法主要包括：雄激素單用抑制精子發(fā)生、雄 / 孕激素合用于男性避孕、 促性腺激素釋放激素（ gonadotropinreleasing hormone, GnRH） 類似物與雄激素合用等，近年來還有十一酸睪酮、睪酮環(huán)丁酯等。而中草藥也因其毒副作用而被中止研究。抗精子疫苗是一種令人興奮的避孕手段，已 引起 研究者廣泛的興趣。綜上所述， 運用避孕疫苗控制 人類 生育 是一條有效而可行的新途徑 ，但 如何提高 疫苗 的有效性 、安全性 和 可行性 仍需 深入 研究。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抗 FSHR 抗 體能夠維持 300 天以上，通過抑制 FSH 與其特異性受體的結(jié)合，形成了體內(nèi)特殊的“ FSH 不足”的狀態(tài)，干擾精子發(fā)生過程而導(dǎo)致不育。以上研究初步證明， FSHR 疫苗可望作為一種安全、有效、可逆的男性避孕疫苗。近期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Eppin 14 與精子的發(fā)育和成熟有關(guān) ， 它可以阻止精子蛋白酶對附睪上皮細(xì)胞的損害，進(jìn)而維持精子成熟 所需的 正常 附睪液體環(huán)境；此外， Eppin 在調(diào)控精子功能和存活上起重要作用。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 9 只成年雄 猴中 有 7 只血清中出現(xiàn)了高滴度的 Eppin 抗體且都不能使雌猴受孕 ，另外 2 只因未能產(chǎn)生足夠的抗體而中途退出，提示維持高滴定度 Eppin 抗體的雄猴無生育力；免疫停止后有 5 只 雄猴 恢復(fù)了生育力 ，且 未出現(xiàn)自身免疫 性 疾病 。 男性 避孕疫苗的研 發(fā) 符合《綱要》中有關(guān) “ 人口與健康 ” 研究領(lǐng)域的要求和人民的需求， 研究 成果 是男性避孕研究領(lǐng)域的重大突破 ，具有重要的理論價值和 廣闊的應(yīng)用前景，必將產(chǎn)生重大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益 。 2．課題申請單位及主要參與單位研究基礎(chǔ)（已有的研究開發(fā)經(jīng)歷，科技成果、科研條件與研究開發(fā)隊伍現(xiàn)狀等） 本課題組已具備相關(guān)的軟硬件基礎(chǔ)和經(jīng)驗積累，其中包括： 體外成功表達(dá)三種代表性FSH 受體多肽并完成了部分動物實驗研究； Eppin 蛋白的制備、純化和 動物 免疫， 并具備相關(guān)的技術(shù)、方法和儀器 。上 述所有條件為本課題的順利實施提供了重要的人才保 障 。根據(jù)我們的前期工作，在該蛋白 18位到 38 位氨基酸之間選擇部分序列分別合成三段多肽（ 1827， SKVTEIPSDL； 2534，SDLPRNAIEL； 2938， RNAIELRFVL）制成 FSHR 多肽 混合 疫苗。 Eppin 蛋白疫苗的制備 運用 PCR 選擇擴(kuò)增 Eppin 蛋白 cDNA 序列 70423 段（該序列缺乏 Eppin 基因序列的 N端分泌信號），并運用 Qiaquick PCR 純化試劑盒純化 PCR 產(chǎn)物，然后再連接到PET100D/TOPO 質(zhì)粒中，用 Top10 細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，選擇提取陽性克隆細(xì)胞 DNA，經(jīng)測序后得到正確的 PET100D/Eppin 質(zhì)粒。 疫苗的有效性研究 免疫原性及藥代動力學(xué)研究 1）免疫劑量與抗體水平的關(guān)系研究： A．動物選擇及免疫：根據(jù)前期的實驗結(jié)果，以雄性彌恒猴為研究對象，選擇性功能正常、有生育史的成年健康猴，隨機(jī)分為 3 個皮下注射免疫組、 3 個肌肉注射免疫組和 1 個對照組，每組 5 只動物，體重波動在平均體重的 20%以內(nèi)；免疫組一次性給予低、中、高 17 三個劑量的疫苗，對照組給予等量 佐劑。 D．根據(jù)抗體發(fā)生的動態(tài)規(guī)律以及動物的生殖機(jī)能狀況，評價最佳 的免疫劑量和免疫途徑。 C．在抗體 檢測的同時，選擇適當(dāng)時期，對動物生殖機(jī)能（生殖激素水平、精液和精子質(zhì)量、睪丸和附睪組織）進(jìn)行評價，進(jìn)一步研究抗體的水平與生殖機(jī)能的相關(guān)性。 主要藥效學(xué)研究 1）動物選擇及免疫：按上述標(biāo)準(zhǔn)選擇雄性彌恒猴，隨機(jī)分為免疫組和對照組，每組 10 只動物；按照上述研究確定的免疫劑量和 免疫程序?qū)游镞M(jìn)行為期 2 年的免疫，對照組給予等量的佐劑；同時選擇相同數(shù)量的、健康的雌性彌恒猴，以作為動物生育力評價時使用。 5）生育力恢復(fù)研究 A，停止免疫后的 12 年內(nèi)，繼續(xù)動態(tài)檢測動物機(jī)體的性激素、性功能、精子生成、精液質(zhì)量，評價其生殖技能 的恢復(fù)情況； B，停止免疫后，根據(jù)血液中抗體的水平，選擇合適時機(jī)與雌性動物按 1： 1 比例進(jìn)行交配，觀察動物的受孕情況、妊娠過程以及妊娠結(jié)局等，評價其生育力的恢復(fù)情況。將睪丸組織切片病理分析， 觀察細(xì)胞 的組織形態(tài)學(xué)改變 ， 計數(shù)初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞和精子。 ??精子計數(shù)在接種后 30 天開始下降，到 60 天時下降有統(tǒng)計學(xué)差異（ P ）。 2）長期毒性試驗 分別以大鼠和狗為實驗對象，大鼠連續(xù)經(jīng)口給予疫苗 6 個月，狗連續(xù) 912 個月，對動物進(jìn)行外觀體征、行為活動、攝食量、體重、糞便狀況、給藥局部反應(yīng)、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)的觀察。 （二） 主要技術(shù)指標(biāo)（如形成的知識產(chǎn)權(quán)、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、新技術(shù)、新產(chǎn)品、新裝置、論文專著等數(shù)量、指標(biāo)及其水平，與國內(nèi)外 同類技術(shù)或產(chǎn)品的競爭分析，滿足項目所依托的重大工程建設(shè)或重大裝備研制的需求情況等） 1．主要研究的技術(shù)指標(biāo) 1）疫苗的制備：運用體外重組技術(shù)結(jié)合免疫吸附法和免疫印跡法表達(dá)、純化和鑒定 FSHR多肽和 Eppin 蛋白；選擇合適的佐劑、穩(wěn)定劑和防腐劑（必要時）制成疫苗； 2）疫苗的質(zhì)量控制：測定疫苗中 FSHR 多肽或 Eppin 蛋白的含量，分析疫苗中的雜質(zhì)（包括宿主蛋白），研究在不同條件下疫苗的穩(wěn)定性、比較不同批次疫苗的一致性，測定疫苗的理化性狀，運用計算機(jī)模型結(jié)合質(zhì)譜分析研究 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白的空間結(jié)構(gòu)； 3）疫苗的免疫原性：研究動物免疫后，血清、精液、睪丸和附睪等組織中抗體的滴度及其變化，與特異性靶細(xì)胞或組織的結(jié)合能力，抗體在體內(nèi)的消減等，評價疫苗使用量和免疫途徑及間隔時間與抗體發(fā)生之間的關(guān)系。 4． 與國內(nèi)外同 類技術(shù)和產(chǎn)品的競爭分析 1） 開發(fā)出安全、有效、可逆的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的男性避孕疫苗，研究成果達(dá)國際領(lǐng)先水平。 3）在研究的同時，將與相關(guān)企業(yè)緊密合作，爭取早日投放市場，造福與人類。 安全、高效、可逆的 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白男性避孕疫苗的成功研制、規(guī)?；a(chǎn)及市場推廣，將有助于解決困擾千千萬萬家庭的避孕難題， 能 帶來極大的社會及經(jīng)濟(jì)效益 ， 具有良好的市場前景 ， 尤其是占中國人口大多數(shù)的農(nóng)村人口及城市外來人口 將 是男性避孕疫苗的潛在用戶。但疫苗的制備將逐步從實驗室過度到企業(yè)，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐可a(chǎn)，生產(chǎn)線所需技術(shù)簡單，以無菌、混配、定量灌裝為主，一般的小型制藥公司即可滿足。 他們良好的科研素質(zhì)、極大的工作熱情和敬業(yè)精神，使本課題組成為具有良好發(fā)展前景和合作精神的科研團(tuán)隊。