【正文】 三 年 1） 深入研究 影響胚胎干細胞向心肌細胞和肝細胞 分化的 組蛋白去甲基化酶和miRNA，并 確定其影響的分化階段 和作用機制；繼續(xù)研究重編程相關(guān)蛋白的功能；應(yīng)用動物疾病模型開展 ARC細胞的體內(nèi)安全性評估 ； 2） 進一步研究 MOF, JMJD2A/2B,JMJD5等在胚胎干細胞和分化體細胞中對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，尤其在異染色質(zhì)向常染色質(zhì)轉(zhuǎn)換過程中的功能；全面完成 PRC2的機理研究；完成 的研究，并繼續(xù)研究該分子伴侶的體內(nèi)作用；繼續(xù)組蛋白甲基化繼承 性機制研究； 3） 深入開展對所研究的重要表觀遺傳復(fù)合物，如 SET1 復(fù)合物， TET1 復(fù)合物， PRC2 復(fù)合物， WICH 復(fù)合物等的體外重構(gòu)和結(jié)構(gòu)解析研究；繼續(xù)對新獲得的表觀遺傳調(diào)控因子及復(fù)合物開展結(jié)構(gòu)解析工作；深化對所解結(jié)構(gòu)的功能分析和突變體研究；與課題組 4 合作， 根據(jù)所獲得的表觀遺傳調(diào)控蛋白或復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)信息、開展小分子化合物的設(shè)計、合成、篩選工作。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用計算機輔助設(shè)計化學(xué)合成一些新的小分子化合物。其中單個蛋白的結(jié)構(gòu) 2～ 4個，復(fù)合體結(jié)構(gòu) 3～ 4個。 第 二 年 1） 進一步篩選參與胚胎干細胞向心肌細胞定向分化的組蛋白去甲基化酶和miRNA。 4） 表達出 10 個不同的表觀遺傳修飾酶和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換蛋白復(fù)合物的可溶性片段，并進行分離純化和蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選，找出 25個蛋白的初步晶體生長條件；設(shè)計并合成一系列基于先導(dǎo)化合物的小分子；設(shè)計并合成幾個特定的小分子化合物探針。在此基礎(chǔ)上，對表現(xiàn)較好的目標(biāo)蛋白展開結(jié)晶條件搜索與優(yōu)化，及晶體結(jié)構(gòu)解析。 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1） 完善由胚胎干細胞向心肌細胞和肝細胞分化的技術(shù)平臺； 篩選參與胚胎干細胞 向 心肌細胞和肝細胞定 向分化的表觀遺傳調(diào)控酶、復(fù)合物及 miRNA；以 活化前后卵母細胞蛋白質(zhì)譜為基礎(chǔ)， 篩選與鑒定重編程因子； 建立重編程調(diào)控因子的過表達細胞品系；建立心肌 (局部 )梗死動物模型、研究ARC干細胞分化而來的心肌細胞治療心肌梗死的療效 ； 2） 利用 chipseq 的方法研究胚胎干細胞分化為心肌細胞和肝細胞過程中的全基因組水平上的組蛋白 H3\H4乙?；图谆揎椬V；驗證干細胞定向分化過程中的表觀遺傳調(diào)控基因和其他重要基因（如轉(zhuǎn)錄因子）的表達譜式、 miRNA 表達譜式； 利用生化手段研究 PRC2 被激活的機理及該激活體系在細胞內(nèi)的作用 ；研究 用機制；建立組蛋白修飾定位的高通量測序平臺，從時間順序上研究組蛋白修飾的繼承性模式。 6) 利用小分子化合物探針來探明新靶點蛋白，并進行結(jié)構(gòu)和功能的研究： 將已知的活性小分子化合物作為分子探針，利用熒光標(biāo)記，識別及 Biotin 偶聯(lián)等化學(xué)生物學(xué)手段來探明在 iPS 的重編程及定向分化過程中起重要作用的蛋白。擬采用計算機輔助設(shè)計出一些結(jié)構(gòu)類似物并通過現(xiàn)代有機合成化學(xué)的手段制備這 些小分子。利用生化、細胞水平的分析（包括等溫滴定量熱， GST pull down，熒光偏振，轉(zhuǎn)染，免疫共沉淀，基因抑制，熒光定位等手段）來研究突變體對蛋白質(zhì)復(fù)合物功能的影響，闡明結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。得到初始相位后，利用 Coot， PHENIX 等軟件進行模型的修正，最終得到符合晶體學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)收集將主要在上海光源（ SSRF）和日本同步輻射（ PF）進行。 1) 蛋白質(zhì)的制備和蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝 ：利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，對本項目提出的蛋白質(zhì)復(fù)合物進行表達并分離純化；通過表達系統(tǒng)內(nèi)組裝和純化后體外組裝兩種方式對蛋白質(zhì)復(fù)合物進行組裝； 2) 復(fù)合 物晶體的獲得與優(yōu)化 ：蛋白質(zhì)復(fù)合物組裝之后，進行晶體學(xué)篩選工作。 3. 利用以上平臺分別從時間和空間順序上研究組蛋白修飾的繼承性模式； 承性相關(guān)酶的工作機理及在干細胞分化與重編程中的作用。 4) 研究： 1. 尋找 的專一性分子伴侶（已完 成）； 2. 利用生化手段研究該分子伴侶的作用機制； 3. 研究該分子伴侶的干細胞分化與重編程中作用。應(yīng)用基因過表達及沉默或基因敲入及敲除、免疫共沉淀等手段，對所選擇的一些關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)相互作用、體內(nèi)體外功能等研究，深入發(fā)掘其功能，找到重編程關(guān)鍵蛋白； 3) 利用 iPS 細胞來源的心肌細胞的心梗疾病的功能修復(fù)及安全評估： 通過不含病毒介質(zhì)的方法體外誘導(dǎo) iPS 細胞，將 ARC 抗心肌細胞凋亡蛋白轉(zhuǎn) 染至 iPS細胞中，建立 ARC干細胞系，篩選后誘導(dǎo)其分化為心肌細胞；然后建立心肌梗死疾病模型，將誘導(dǎo)分化得到的心肌細胞注射至心肌梗死處，分子和生物化學(xué)水平鑒定心肌梗死的修復(fù)程度，并建立動物體內(nèi)安全性評估體系。 三、研究方案 課題１ 干細胞向心肌細胞和肝細胞定向分化與 重編程中重要的和新的表觀遺傳蛋白及復(fù)合物的篩選與功能研究 1) 定向分化過程中的重要表觀遺傳組蛋白修飾酶和 miRNA 的篩選與功能分析 ： 應(yīng)用干細胞向心肌細胞和肝細胞不同分化時段的樣品，結(jié)合實時定量 PCR 的結(jié)果選取候選蛋白；建立穩(wěn)定的基因過表達和小分子干擾（ siRNA）的干細胞細胞系，分析組蛋白修飾酶對干細胞的功能影響；結(jié)合生物信息學(xué)、表觀遺傳學(xué)和生物芯片的分析，分析靶基因、表觀遺傳修飾的變化，確定表觀遺傳蛋白及復(fù)合物在干細胞分化過程中的作用機制； 2) 重編程關(guān)鍵蛋白的篩選與功能分析： 以活化前后卵母細胞蛋白 質(zhì)譜為基礎(chǔ)，通過對這些細胞的胞質(zhì)和核蛋白進行比較，通過圖像分析，數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計找到蛋白表達的差異。 五年 預(yù)期 目標(biāo)： 1． 篩選和鑒定一批調(diào)控胚胎干細胞向 心肌細胞和肝細胞定向分化 及重編程命運的表觀遺傳調(diào)控蛋白 及復(fù)合物； 2． 完成不少于 10 個參與 干細胞定向分化和重編程的 重要表觀遺傳調(diào)控蛋白及相關(guān)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的解析； 3． 合成、篩選和優(yōu)化不少 于 3 種 參與干細胞定向分化和重編程的小分子化合物； 4． 建立 2 套干細胞高效定向分化技術(shù)和 1 套安全性評估系統(tǒng)，即 ： ? 建立一套干細胞向 心肌細胞 分化和一套向 肝細胞定向 高效 分化 的技術(shù)體系； ? 在細胞、動物模型個體水平上分析胚胎干細胞體外定向分化細胞的有效性及潛在風(fēng)險的安全評估。 項目名稱： 干細胞分化與重新編程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究 首席科學(xué)家： 孫方霖 清華大學(xué) 起止年限： 至 依托部門： 教育部 二、預(yù)期目標(biāo) 總體目標(biāo)： 本項目瞄準(zhǔn) 干細胞定向分化與重編程過程中表觀遺傳修飾調(diào)控這一重大基本問題， 整合 了 國內(nèi) 在表觀遺傳蛋白的功能研究與表觀遺傳蛋白結(jié)構(gòu)研究 團隊 的各自優(yōu)勢 ， 開展 從 功能 到 結(jié)構(gòu) ， 結(jié)構(gòu) 到 小分子化合物 的研究 。在已有基礎(chǔ)上力爭：1）從功能 水平上揭示表觀遺傳 修飾及調(diào)控蛋白和復(fù)合物對胚胎干細胞向 心肌細胞和肝細胞定向分化 及重編程的命運決定以 及發(fā)揮功能的機制； 2）解析參與定向分化和重編程的關(guān)鍵蛋白及復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu) 及 蛋白作用 網(wǎng)絡(luò) ，建立 一個 國際一流水平的表觀遺傳調(diào)控蛋白三維結(jié)構(gòu)與功能的信息平臺，為深入研究干細胞定向分化與重編程的機制提供理論基礎(chǔ)； 3） 在功能、機制和三維結(jié)構(gòu)信息的基礎(chǔ)上設(shè)計出可高效誘導(dǎo)胚胎干細胞定向分化和 iPS 重編程的小分子化合物； 4） 獲得一批有自主知識產(chǎn)權(quán)的重要成果， 為干細胞應(yīng)用于心臟和肝臟等重要疾病的細胞治療提供前期工作基礎(chǔ)。 5． 通過系統(tǒng)性的功能機制研究，爭取弄清組蛋白修飾、 DNA 甲基化、染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)及其轉(zhuǎn)換在干細胞定向分化和重編程中的作用機制與 規(guī)律性，為從染色質(zhì)水平靶向誘導(dǎo)提供基礎(chǔ)； 6． 在 國際核心刊物及其他有影響力的學(xué)術(shù)刊物 （ IF5）上發(fā)表論文 2025 篇 ,爭取 在國際一流雜志（ IF10）發(fā)表論文 1012 篇 （其中 Nature、 Cell、Science 34 篇）； 7． 申請 6 項以上發(fā)明專利 ； 8． 培養(yǎng)博士研究生、博士后人員 30 人以上； 9． 通過參與本項目研究的專家團隊，依托清華大學(xué)為蛋白三維結(jié)構(gòu)解析技術(shù)平臺，建立一個表觀遺傳調(diào)控蛋白的三維結(jié)構(gòu)與功能數(shù)據(jù)庫，帶動國內(nèi)干細胞與表觀遺傳學(xué)的相關(guān)研究。利用 Western 印記和免疫組化等技術(shù)來確定發(fā)掘的蛋白之間的表達差異，以及對這些蛋白的表達模式和亞細胞定位進行初步研究。 課題２ 干細胞定向分化與重編程中重要組蛋白修飾、染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換調(diào)控和核小體組裝蛋白及復(fù)合物發(fā)揮功能的分子機制 1) 染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的研究： 利用 Chipseq 研究干細胞定向分化與重編程中重要組蛋白修飾變化規(guī)律；利用 DNA 甲基化及 DNAseI 研究干細胞定向分化與重編程中染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)特點； 2) 影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)換的重要蛋白的功能機制的研究： 利用 RNAi 或過表達研究參與調(diào)控異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)向常染色質(zhì)轉(zhuǎn)換的作用蛋白的功能與調(diào)控機制；利用生化和其他方法研究表觀遺傳修飾結(jié)合蛋白復(fù)合物在分化與重編程中動態(tài)作用機制； 3) PRC2 的機理研究： 1. 體外重組 PRC2 復(fù)合物并建立活性測定體系（已完成）；2. 尋找其激活因子（已完成）； 3. 利用生化手段研究其被激活的機理； 4. 研究該激活體系在干細胞分化與重編程中的作用和機理； 5. 尋找拮抗 PRC2 活性并阻遏其蔓延的分子機理。 5) 組蛋白甲基化繼承性機制研究： 1. 建立組蛋白修飾定量質(zhì)譜學(xué)分析平臺（已完成）； 2. 建立組蛋白修飾定位的高通量測序平臺 。 課題３和課題 4 干細胞定向分化和重編程中調(diào)控組蛋白修飾、 DNA 甲基化相關(guān)蛋白質(zhì)及復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)解析、小分子化合物的設(shè)計、篩選和優(yōu)化 通過從表 觀遺傳激活修飾，表觀遺傳沉默修飾以及染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)調(diào)控三個層面對參與干細胞重編程與分化的一些關(guān)鍵表觀遺傳因子及復(fù)合物進行結(jié)構(gòu)研究和表觀遺傳機制的探索；以目前已知的或基于結(jié)構(gòu)獲得的小分子為先導(dǎo)化合物，進行結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化、設(shè)計合成效率更高，毒副作用更低的新型小分子，并探明其新的靶標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。對得到的初始條件進行結(jié)晶條件的優(yōu)化，通過改變各個結(jié)晶溶液的組分，蛋白質(zhì)的濃度，溫度等操作提高晶體的質(zhì)量已適應(yīng)結(jié)構(gòu)解析的需要。 3) 復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析 ：采用硒代甲硫氨酸標(biāo)記蛋白或重原子浸泡的方法來得到解決相位問題。 4) 生物學(xué)功能研究： 基于三維結(jié)構(gòu)信息，運用基因工程技術(shù)對活性位點，結(jié)合表面等中重要的位點 進行氨基酸定點突變。 5) 基于已知小分子化合物或已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小分子進行小分子的的結(jié)構(gòu)修飾優(yōu)化、設(shè)計、合成和篩選：： 目前已經(jīng)知道幾種小分子化合物 (如 VPA, IDE1,ID8和 Kenpaullone等 )具有一定或較好的誘導(dǎo) iPS細胞重編程和定向分化的功能。該類小分子化合物在經(jīng)過柱層析和 HPLC 提純后，將被用于干細胞實驗中并檢驗其功能。在確定為新蛋白或蛋白新功能的基礎(chǔ)上，開展蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究。 3） 系統(tǒng)開展在干細胞定向分化和重編程過程中調(diào)控 H3K4甲基化、 H3K27甲基化、 H4K16 乙酰化以及 DNA 甲基化等重要表觀遺傳修飾的表觀遺傳因子的分子克隆、基因表達（包括可表達片段的鑒定與篩選）以及蛋白純化工作。 4） 表達、分離和純化 PRC2復(fù)合物、 RBPJMJD2 家族蛋白等，尋找晶體生長的初步條件；以幾種已知的小分子化合物為先導(dǎo)化合物 ，設(shè)計并合成結(jié)構(gòu)類似物小分子；將已知的活性小分子化1） 完成各種技術(shù)平臺的建立；基本完成參與胚胎干細胞向心肌細胞和肝細胞分化的重要表觀遺傳調(diào)控酶和 miRNA的篩選，并確定 34個調(diào)控分化的組蛋白去甲基化酶和 miRNA；找到卵母細胞活化前后差異表達的蛋白；建立ARC干細胞系，完成 ARC干細胞治療心肌梗死的療效； 2） 初步完成 Chipseq 對胚胎干細胞分化為心肌細胞和肝細胞過程中 H3/H4乙?；图谆揎椬V式的鑒定；研究 PRC 作用機制；建立組蛋白甲基化繼承性機制研究的平臺； 3） 進行目標(biāo)蛋白的大規(guī)模體外重組表達篩選與檢測，分離與純化 10～ 15 種以上目標(biāo)蛋白；完成已純化目標(biāo)蛋白的結(jié)晶條件搜索和優(yōu)化，解析 4～ 6個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 合物作為分子探針，探明在 iPS重編程及定向分化中起重要作用的蛋白。分別建立穩(wěn)定的瞬時和穩(wěn)定基因過表達和小分子 RNA干擾的胚胎干細胞系；對關(guān)鍵表觀遺傳因子和miRNA 在定向分化中調(diào)控功能進行初步研究；初步應(yīng)用候選組蛋白去甲基化酶誘導(dǎo) iPS形成；利用生化技術(shù)確定發(fā)掘蛋白之間的表達差異，開展對選擇蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)相互作用等功能研究；研究 ARC干細胞的抗凋亡和向心肌細胞分化的能力； 2） 繼續(xù) Chipseq結(jié)果的分析；研究重要表觀遺傳調(diào)控因子，包括 HP JMJDJARID1B、 JMJD2A/B、在干細胞和分化的體細胞中對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和表觀遺傳修飾的影響及規(guī)律； 初步完成 PRC2的機理研究；完成 的研究，