【正文】 HLADRB1 特異性 T 細(xì)胞株 RA 患者 T 細(xì)胞 新抗原誘導(dǎo)鼠關(guān)節(jié)炎模型 已完成 前期組學(xué)研究 蛋白質(zhì)組 滑膜 cDNA 文庫 8 RA 的自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究 抗原 T 表位 表位改造 Mimogen 表位數(shù)據(jù)庫 免疫信息學(xué)分析 In Silico 實驗 /預(yù)測 遞送系統(tǒng) 免疫應(yīng)答特征 作用機(jī)理 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞 糖表位 TCR特性 活化相關(guān)膜分子 T 細(xì)胞活化功能 T 細(xì)胞亞型 亞型分布 RA 患者外周血單個核細(xì)胞 流式 1. 應(yīng)用抗 亞型特異性 抗體清除 小 鼠 γ δ T 細(xì)胞亞群 2. 分離 Vγ1和 Vγ4 γδ T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 膠原性關(guān)節(jié)炎 小鼠 新靶向在 膠原性關(guān)節(jié)炎中的治療實驗 對膠原性關(guān)節(jié)炎的影響 分選 動物實驗驗證 闡明 γδT 細(xì)胞亞型在 RA 中的作用 9 RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷機(jī)制： RA 細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控機(jī)理研究： 已完成 間充質(zhì)干細(xì)胞 RA 相關(guān) 小分子 上調(diào)或下調(diào) RA 患者 外周血不同 細(xì)胞 亞群中小分子 表達(dá) CIA Treg 亞群 關(guān)節(jié)炎評分 關(guān)節(jié)病理 X 線評分 新生 兒 臍帶 血 RA 患者 T 細(xì)胞功能 致炎性 細(xì)胞因子 分泌 T 細(xì)胞增殖 細(xì)胞活化 及分化功能變化 細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化 增殖與凋亡 T 細(xì)胞表面功能蛋白表達(dá) 外周血不同細(xì)胞亞群中上述小分子水平的變化 差異表達(dá)芯片 小分子作用 靶 點(diǎn) 芯片鑒定 RA 患者 PBMC 中小分子表達(dá)譜 靜脈注射 不同亞型分布 亞型分選 不同亞型 Treg 對致病性 T 細(xì)胞的抑制功能 Fexp3/IL10 Tg 誘導(dǎo) CIA CIA 靜脈注射 滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng) 炎癥細(xì)胞體外培養(yǎng)（ Th17/Th1） 滑膜細(xì)胞與 Th17/Th1共培養(yǎng) 對滑膜細(xì)胞增殖功能的影響 對滑膜細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子的影響 對 滑膜細(xì)胞產(chǎn)生骨破壞介質(zhì) 的影響 骨破壞相關(guān)信號通路變化 靜脈注射 給CIA 小鼠 觀察 對 骨破壞、炎 性因子分泌及滑膜增生的影響 IL17 下游轉(zhuǎn)錄分子與途徑鑒定 IL6/IL8 基因敲除小鼠驗證IL6/IL8 在 IL17通路中作用 Th17 RA 滑膜炎癥和損傷作用與調(diào)控途徑 合成靶向 DKK1 基因的 siRNA 去 IL17 血清過繼轉(zhuǎn)移，觀察CIA 發(fā)病率 10 RA 易感基因及早期診斷靶標(biāo)研究： RA 干預(yù)新策略的研究： 免疫啟動環(huán)節(jié) 免疫調(diào)控環(huán)節(jié) 炎癥環(huán)節(jié) 骨破壞環(huán)節(jié) RA 相關(guān)炎癥靶點(diǎn) OPGHSP 重組蛋白 RANKL TNF 樣區(qū)疫苗 人源化抗 CYR61 單抗 以 CIA 鼠模型為平臺 機(jī)制研究 療效評價 HLADRB1 特異性變構(gòu)肽 HDACi 同工酶 RA 特異性血清標(biāo)志分子 大樣本 RA患者中的驗證 基因芯片掃描 利用多種分子生物學(xué)技術(shù)研究新 RA易感基因的致病機(jī)制 EXONCAPTURE 高通量 Solexa 分析 國外報 道的RA相關(guān) SNP 新 RA相關(guān)SNP 鑒定得到的 CNP基因 全基因組 CGH芯片篩選 CNP基因 (已完成 ) 蛋白組學(xué)鑒定 臨床診斷靶標(biāo)的應(yīng)用研究 RA易感基因 高通量Solexa 分析 高通量Solexa 分析 RA 差異 miRNA 譜 11 （三）可行性分析： 1. 前期工作基礎(chǔ) ： 1）團(tuán)隊內(nèi)前期取得了大量研究成果，本項目是對這些原創(chuàng)性研究的進(jìn)一步深入和轉(zhuǎn)化，保證了項目預(yù)期目標(biāo)和研究方案的可行性。在上述 RA 發(fā)病的新的免疫學(xué)機(jī)制研究基礎(chǔ)上，我們將從 RA 發(fā)病的不同環(huán)節(jié)，充分把握本團(tuán)隊的創(chuàng)新性和突破性，對 RA 早期診斷和免疫干預(yù)新策略 進(jìn)行深入研究。 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞的功能及免疫調(diào)控 是連接自身抗原始動和炎癥效應(yīng)階段的橋梁，是 RA 病理免疫反應(yīng)的核心，深入探討其作用機(jī)制，是 RA 發(fā)病機(jī)制研究必不可少的組成部分。 其中對 RA 易感基因 等 RA 發(fā)病的免疫遺傳學(xué)機(jī)制研究對于闡明 RA 的遺傳特性和基因早期診斷及免疫干預(yù)策略研究具有重要意義。 6 三、研究方案 (一 )總體研究思路： RA 是一種復(fù)雜性狀疾病，多種關(guān)鍵性因素在 RA 發(fā)病過程的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，因此，必須從 RA 發(fā)病的各環(huán)節(jié)進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，才能使其發(fā)病機(jī)制得到充分認(rèn)識。 13. 對有臨床應(yīng)用前景的研究結(jié)果申請 相關(guān) 專利。 11. 探討一系列針對 RA 發(fā)病不同環(huán)節(jié)的新的免疫干預(yù)策略，在 RA 動物模型中觀察其療效，并探討其作用機(jī)制。 9. 闡明 RA 炎癥啟動、進(jìn)展和骨破壞過程中免疫細(xì)胞與滑膜細(xì)胞之間的相互作用及其分子機(jī)制。 7. 探討間充質(zhì)干細(xì)胞對 RA 免疫負(fù)調(diào)控中的作用機(jī)制，探索新的 RA 免疫干預(yù)策略 。 5. 闡述抗原表位結(jié)構(gòu)、 T 細(xì)胞表面糖表位及其他表面分子對自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制 ，探討 其臨床應(yīng)用價值。 3. 系統(tǒng)分析 RA 特異性 修飾 抗原特征及致病機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 系統(tǒng)分析前期工作中新發(fā)現(xiàn)的 RA 易感基因、特征性 SNP 和 CNP 基因位點(diǎn)在中國人群 RA 患者中的遺傳易感性，并對其參與致病的免疫遺傳學(xué)機(jī)制進(jìn)行闡述。 上述 主要研究內(nèi)容緊緊圍繞關(guān)鍵科學(xué)問題， 從 RA 的自身免疫應(yīng)答啟動、異常免疫應(yīng)答及炎癥和組織破壞等不同階段深入探討 RA 發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制，并對RA 臨床診斷新靶標(biāo)和免疫干預(yù)新方法進(jìn)行研究，是各課題密切關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)性的基礎(chǔ)和臨床基礎(chǔ)研究工作，基礎(chǔ)與臨床有機(jī)結(jié)合，有望全面系統(tǒng)地闡述 RA 發(fā)病各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵性分子，并使我國 RA 的創(chuàng)新性研究達(dá)到國際前沿水平。 6. RA 干預(yù)新策略的研究 ： 本項目組成員既往圍繞上述 RA 發(fā)病的各環(huán)節(jié)進(jìn)行了大量的原創(chuàng)性研究。 5. RA 易感基因及早期診斷靶標(biāo)研究 ：本團(tuán)隊已經(jīng)建立了先進(jìn)的 RA 遺傳易感性研究平臺，本項目從 RA 易感基因鑒定、單核甘酸多態(tài)性和拷貝數(shù)多態(tài)性分析等層面對 RA 發(fā)病的免疫遺傳學(xué)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，進(jìn)一步大樣本分析前期發(fā)現(xiàn)的 RA 易感基因的遺傳 特性和致病機(jī)制。并在前期芯片篩選結(jié)果基礎(chǔ)上，對我們發(fā)現(xiàn)的新的 RA 相關(guān)小分子進(jìn)行研究，探討其對各種免疫細(xì)胞增殖和分化功能以及膠原性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的影響。本項目組前期對上述負(fù)調(diào)控機(jī)制在 RA 中的3 作用進(jìn)行了大量研究。 3. RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷機(jī)制 ：在前期原創(chuàng)性研究基礎(chǔ)上，從滑膜炎癥的啟動、進(jìn)展及骨破壞等不同階段，在分子、細(xì)胞及一系列基因敲除動物層面，利用抗體阻斷、 RNA干擾和基因轉(zhuǎn)染等方法深入研究 Th17與滑膜細(xì) 胞的相互作用，系統(tǒng)闡述 Th17 細(xì)胞調(diào)控滑膜炎癥和骨破壞的分子通路，為發(fā)現(xiàn) RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷的新機(jī)制，尋找 RA 新型治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。 主要研究內(nèi)容包括： 1. RA 相關(guān)新型自身抗原鑒定及修飾特點(diǎn)研究 ： 在前期組學(xué)基礎(chǔ)上，對本團(tuán)隊已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的新 RA 自身抗原進(jìn)行表位功能、 HLADRB1 結(jié)合特性、 T 細(xì)胞活化、關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)能力等實驗研究，并對這些新抗原的翻譯后修飾特征以及修飾后抗原功能的改變進(jìn)行系統(tǒng)分析，從 分子、細(xì)胞、動物、 RA 患者外周血等不同層面闡述上述新抗原在 RA 中的致病作用，使 RA 發(fā)病機(jī)制研究在分子水平上取得突破性進(jìn)展。1 項目名稱： 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制及其干預(yù)策略的研究 首席科學(xué)家： 栗占國 北京大學(xué) 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 教育部 2 一、研究內(nèi)容 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題包括： 從 RA 發(fā)病過程的各環(huán)節(jié)，深入探討 RA 發(fā)病的免疫應(yīng)答及調(diào)控機(jī)制，尋找其中關(guān)鍵性分子，為 RA 早期診斷和免疫干預(yù)新策略的研究奠定基礎(chǔ) 。 本項目將緊密圍繞這一關(guān)鍵問題，從 RA 自身抗原鑒定和特征性修飾特征、 RA 特異性自身免疫反應(yīng)及負(fù)調(diào)控機(jī)制、滑膜炎癥和骨破壞的新分子機(jī)制以及免疫遺傳學(xué)等方面對 RA 發(fā)病的免 疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，并在此基礎(chǔ)上，尋找創(chuàng)新性及特異性的 RA 早期診斷和免疫干預(yù)的新方法。 2. RA的自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究 ：本 項目組長期從事 RA自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究，在成熟的免疫學(xué)研究平臺基礎(chǔ)上，對抗原特異性 T細(xì)胞的自身免疫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行深入研究，以項目組前期工作發(fā)現(xiàn)的新抗原為模型，系統(tǒng)探討抗原特異性 T細(xì)胞抗原表位誘導(dǎo)的 T細(xì)胞活化、新發(fā)現(xiàn)的 T細(xì)胞表面分子免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制等原創(chuàng)性研究，為 RA自身免疫應(yīng)答新機(jī)制研究提供重要實驗依據(jù)。 4. RA 細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控機(jī)理研究 ：調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等具有抑制功能的免疫細(xì)胞和小分子是近年來新發(fā)現(xiàn)的自身免疫負(fù)調(diào)控的重要靶標(biāo)，在 RA中的功能及作用機(jī)制研究還剛起步。在前期工作基礎(chǔ)上，本項目利用我們獨(dú)有的轉(zhuǎn)基因動物平臺和充足的臨床樣本來源，對不同亞型調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞在 CIA 及 RA 患者發(fā)病過程數(shù)量和功能的異常以及免疫 負(fù)調(diào)控機(jī)制、間充質(zhì)干細(xì)胞對 CIA 及 RA 患者 T細(xì)胞活化的抑制作用進(jìn)行了深入探討。上述新型免疫負(fù)調(diào)控機(jī)制的深入研究將為 RA 免疫干預(yù)策略提供新的靶向。除了易感基因可做為診斷靶標(biāo)外，本研究團(tuán)隊前期工作發(fā)現(xiàn)的一系列血清蛋白或抗原，甚至小分子等均可做為新型診斷靶標(biāo)用于 RA 臨床，本項目將對上述新的血清蛋白標(biāo)志分子或抗原進(jìn)行大樣本研究，為其用于臨床診斷靶標(biāo)提供重要實驗依據(jù)。在前期研究基礎(chǔ)上，本項目利用獨(dú)有的一系列轉(zhuǎn)基因動物模型，從 RA 自身免疫反應(yīng)的啟動、調(diào)控、炎癥反應(yīng)及骨破壞等四個關(guān)鍵環(huán)節(jié)設(shè)計免疫干預(yù)策略，并進(jìn)行體內(nèi)實驗，以傳統(tǒng)緩解病變抗風(fēng)濕藥（ DMARDs）為對照，對不同環(huán)節(jié)的免疫治療方法的療效及機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，為 RA 臨床治療靶向研究提供新的思路。 4 二、預(yù)期目標(biāo) 本項目的總體目標(biāo)： 在本項目組已有的前期工作成果和 基礎(chǔ)之上，針對 RA 發(fā)病的不同環(huán)節(jié)，探討 RA 易感基因、自身抗原特征、自身免疫反應(yīng)及免疫調(diào)控機(jī)制、炎癥和骨破壞發(fā)生發(fā)展機(jī)制，極大推進(jìn) RA 致病的免疫學(xué)機(jī)制的認(rèn)識，形成新的 RA 免疫致病機(jī)制理論；通過早期診斷靶標(biāo)及免疫干預(yù)方法的研究，解決 RA 早期診斷和免疫干預(yù)方法中的關(guān)鍵問題，使我國 RA 的基礎(chǔ)研究和臨床診斷與治療上形成自己的特色，達(dá)到國際水平。 2. 對項目組前 期工作發(fā)現(xiàn)的一系列 RA 自身抗原，利用項目組成熟的表位功能研究和抗原修飾平臺，這些新抗原的致病機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，在此基礎(chǔ)上探索其臨床應(yīng)用價值。 4. 系統(tǒng)分析新發(fā)現(xiàn)的自身抗原特異性 T 細(xì)胞表型和功能特征。 6. 闡明各調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞亞型在 RA 免疫負(fù)調(diào)控中的作用，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 8. 探討一系列小分子參與 RA 自身免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)控的分子機(jī)制。 10. 探討 RA 特異性生物標(biāo)志分子用于臨床診斷靶標(biāo)的意義。 5 12. 研究成果預(yù)期在國內(nèi)外風(fēng)濕病和免疫學(xué)專業(yè)期刊上發(fā)表一系列高水平論文，包括 SCI 收錄文章。 14. 人才培養(yǎng)：計劃培養(yǎng) 學(xué)術(shù)水平高、創(chuàng)新能力強(qiáng)的 中青年學(xué)術(shù)骨干 612 名，博士后、博士和碩士研 究生 2040 名，為 RA 標(biāo)志性分子和發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)和臨床研究形成 一支具有國際影響力的高水平研究隊伍。在綜合本團(tuán)隊及國外實驗室的最新研究進(jìn)展基礎(chǔ)上，我們以遺傳因素 作用下， 致病抗原 啟動 異常自身免疫應(yīng)答 ，進(jìn)而造成關(guān)節(jié) 炎癥及骨破壞這一 RA 發(fā)病的核心途徑為主線 ，對 RA 發(fā)病各環(huán)節(jié)參與致病的關(guān)鍵分子及機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)和全面的研究。自身抗原的識別和結(jié)合是 RA 發(fā)病的啟動階段，尋找新的 特異性自身抗原及翻譯后修飾的致病機(jī)制 研究是解釋 RA 發(fā)病機(jī)制的根本途徑。而炎癥和骨破壞作為上游免疫反應(yīng)導(dǎo)致的直接致病效應(yīng)，在 RA 發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，是發(fā)病機(jī)制上游環(huán)節(jié)致病作用的驗證，也為新 的免疫干預(yù)策略提供最直接的證據(jù)，因此，對 炎癥和骨破壞啟動及進(jìn)展過程的分子機(jī)制 研究十分重要。 以下是總體研究思路： —學(xué)術(shù)思路圖解 —— RA 發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制 基因異常 特異性自身抗原及修飾 自身免疫反應(yīng)及其調(diào)控 炎癥及組織破壞 診斷標(biāo)志物 免疫干預(yù) 7 （二）技術(shù)路線： 根據(jù)以上學(xué)術(shù)思路，以解決 RA 發(fā)病過