【正文】 應(yīng)激小鼠模型：在小鼠胰島 β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞和 ob/ob或者 db/db小鼠原代胰島細(xì)胞中加入脂肪酸或者衣霉素，通過(guò)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 應(yīng)激標(biāo)志分子 CHOP的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，選擇脂肪酸或者衣霉素的處理濃度和時(shí)間，并確定本課題選用的糖尿病模型小鼠的周齡。測(cè)定空腹血糖、血脂、糖化血紅蛋白等常規(guī)指標(biāo)。同時(shí)，根據(jù)美國(guó)心臟聯(lián)合會(huì)（ AHA）推薦的方法對(duì)所有志愿者進(jìn)行膳食和生活方式指導(dǎo)。探討血漿胰淀素升高與代謝綜合征、胰島素抵抗和 2型糖尿病發(fā)病的相關(guān)關(guān)系。 2) 血脂、炎性細(xì)胞因子與胰淀素表達(dá)及 2型糖尿病的發(fā)生： ? 利用小鼠胰島 β細(xì)胞株 MIN原代培養(yǎng)的小鼠胰島細(xì)胞通過(guò) Realtime PCR 和 Western blot研究炎性細(xì)胞因子（ TNFα、 MCP1）對(duì)胰淀素表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步利用生化與分子生物學(xué)手段探討 TNFα和 MCP1發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。 ? 礦物元素與胰島素抵抗、 2型糖尿病的人群和相關(guān)的機(jī)理研究：采用 ICPMS測(cè)定鈣、鎂、鐵、鋅、硒、鉻，并結(jié)合上述膳食數(shù)據(jù)和血糖、血脂、細(xì)胞因子、以及血漿鐵蛋白水平， 25羥基維生素 D等數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地研究主要礦物元素對(duì) 2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響，并以鐵代謝紊亂為表型的基因敲除小鼠為模型，通過(guò)膳食誘導(dǎo)探討鐵失衡與糖尿病發(fā)生的分子機(jī)制。 ? 維生素與 2型糖尿病的流行病學(xué)研究：運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法、 HPLC電化學(xué)檢測(cè)方法和放射免疫分析分別檢測(cè)紅細(xì)胞膜 B族維 生素，以及血液同型半胱氨酸和 25羥基維生 D的濃度。 此外，將通過(guò) 3次隨訪，進(jìn)一步研究端粒與血糖轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。使用回歸方程對(duì)個(gè)體的端粒長(zhǎng)度與糖尿病發(fā)病之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，在分析中校正年齡， BMI，性別，吸煙狀況等對(duì)端粒有 影響的因素。通過(guò)脂質(zhì)受體分析，篩選糖尿病引發(fā)的與肝癌相關(guān)脂質(zhì)受體，并進(jìn)行功能研究，闡明糖尿病 脂質(zhì)受體 肝癌三者之間的關(guān)系。分析重要靶組織中甲基化差異與基因表達(dá)水平的關(guān)系，以及這些差異與 2型糖尿病發(fā)病的關(guān)系。提取組織的基因組 DNA，采用 MedIP或 MAP的方法對(duì)甲基化 DNA區(qū)域進(jìn)行富集，運(yùn)用深度測(cè)序方法獲得兩組間存在差異的甲基化區(qū)域信息。通過(guò)生物信息學(xué)分析基因變異的出現(xiàn)位點(diǎn)、發(fā)生頻率、 SNP多態(tài)性類型以及與下游表達(dá)蛋白之間的關(guān)系；通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子生物學(xué)手段構(gòu)建變異基因發(fā)揮功能的生物大分子，解析其與野生型功能分子之間的差異，從分子水平獲得基因變異所致的功能分子缺陷；最后使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析野生型和變異基因所導(dǎo)致的體內(nèi)表達(dá)譜的整體變化，建立易感基因與疾病發(fā)生關(guān)聯(lián)的完整模型。從樣本庫(kù)中選取橫斷面病例 對(duì)照人群（ N＝ ~7,000）以及家系樣本（ N＝ ~3,000），研究 SNP與 2型糖尿病及其并發(fā)癥的相關(guān)性，在大樣本北方人群和 5年隨訪的前瞻人群進(jìn)一步驗(yàn)證，確認(rèn)影響 2型糖尿病發(fā)病和糖尿病并發(fā)癥的易感基因，研究遺傳因素與環(huán)境因素（體力活動(dòng)、飲食習(xí)慣等）的相互作用在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的作用。同時(shí)，以本項(xiàng)目其他課題組新發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞應(yīng)激關(guān)鍵因子為研究對(duì)象，分析基因變異與糖尿病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。在圍繞細(xì)胞應(yīng)激開(kāi)展糖尿病及主要并發(fā)癥的分子機(jī)制研究的同時(shí)，將注意重要指標(biāo)的量化和標(biāo)準(zhǔn)化。同時(shí)在中國(guó)人群中分析脂肪酸種類和比例、重要維生素、主要礦物元素等營(yíng)養(yǎng)因素與2型糖尿病的關(guān)系，及其與遺傳因素的交互作用。 三、研究方案 總體研究思路： 本項(xiàng)目的總體研究思路由兩個(gè)部分組成：第一部分主要是研究 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的遺傳因素與環(huán)境因素，以及二者間的相互作用。申請(qǐng) 15－ 20項(xiàng)國(guó)內(nèi)外發(fā)明專利。探討氧化損傷白蛋白誘導(dǎo)血管細(xì)胞的應(yīng)激和損傷，促進(jìn)加速性動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，尋找 新的致病分子、致病環(huán)節(jié)，探索新的干預(yù)途徑； 6. 闡明與 2型糖尿病大血管病變直接相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激變化圖譜；獲得血液或尿液中可用于糖尿病心血管并發(fā)癥早期診斷和病情監(jiān)測(cè)的特異性分子標(biāo)記物，篩選出存在于糖尿病病人呼吸氣體中代謝相關(guān)分子標(biāo)記；為將 GLP1用于糖尿病心血管病并發(fā)癥的防治提供基礎(chǔ)和臨床研究資料。在糖尿病研究領(lǐng)域，培養(yǎng)一支臨床和基礎(chǔ)緊密結(jié)合、適應(yīng) “轉(zhuǎn)化型研究 ”要求的高級(jí)復(fù)合型人才隊(duì)伍。 項(xiàng)目名稱： 2 型糖尿病病理生理變化的分子機(jī)理研究 首席科學(xué)家： 賈偉平 上海交通大學(xué) 起止年限： 至 依托部門(mén)： 上海市科委 教育部 二、預(yù)期目標(biāo) 總體目標(biāo)： 闡明中國(guó)人中與 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的易感基因以及表觀遺傳因素；發(fā)現(xiàn)與 2型糖尿病密切相關(guān)的主要營(yíng)養(yǎng)素失衡及其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)遺傳因素與環(huán)境因素的交互作用對(duì)疾病的影響；確定 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激等細(xì)胞應(yīng)激導(dǎo)致胰島 β細(xì)胞功能障礙、胰島素抵抗的機(jī)制；揭示細(xì)胞應(yīng)激在 2型糖尿病發(fā)展過(guò)程中導(dǎo)致糖 尿病腎病和心血管疾病的分子機(jī)制。獲得一批原創(chuàng)性的科研成果，揭示新的 2 型糖尿病干預(yù)和防治靶點(diǎn)。 五年預(yù)期目標(biāo)： 1. 發(fā)現(xiàn)與中國(guó)人 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的易感基因和表觀遺傳變化；闡明細(xì)胞應(yīng)激關(guān)鍵因子基因變異與 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；闡明遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用機(jī)制；為遺傳因素和環(huán)境因素用于 2型糖尿病及其并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)； 2. 發(fā)現(xiàn)與我國(guó) 2型糖尿病密切相關(guān)的主要營(yíng)養(yǎng)因素；發(fā)現(xiàn) 2型糖尿病易感位點(diǎn)與營(yíng)養(yǎng)因素相互作用 在 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用；明確營(yíng)養(yǎng)失衡與細(xì)胞應(yīng)激在糖尿病中的分子調(diào)控機(jī)制；提出新的營(yíng)養(yǎng)相關(guān)糖尿病危險(xiǎn)因子和病因假說(shuō)及預(yù)防和干預(yù)靶點(diǎn)；為建立適合中國(guó)漢族人群遺傳背景和膳食特點(diǎn)的 2型糖尿病營(yíng)養(yǎng)干預(yù)策略提供理論依據(jù)； 3. 結(jié)合遺傳和環(huán)境因素，初步探討中國(guó) 2型糖尿病患者胰島 β細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的獨(dú)特機(jī)制；闡明脂肪酸通過(guò) FoxO1誘導(dǎo)胰島 β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制；尋找新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子；提供新 2型糖尿病防治靶點(diǎn) 、 篩選新靶點(diǎn)藥物； 4. 探討脂肪、肝細(xì)胞因子的分泌調(diào)控及其在肝細(xì)胞應(yīng)激、肝臟胰島素抵抗及 2型糖尿病中的病理作用 ；開(kāi)發(fā)相關(guān)試劑盒；為脂肪因子及肝細(xì)胞因子用于 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論基礎(chǔ)及臨床依據(jù)；建立基于脂肪/肝臟細(xì)胞因子和脂肪 肝臟中軸的新藥開(kāi)發(fā)平臺(tái)，為靶分子作為藥物開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)； 5. 從線粒體能量代謝角度，探討 UCP2介導(dǎo)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制；從細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和異常轉(zhuǎn)分化的角度，探討足細(xì)胞在高糖環(huán)境下由氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的蛋白尿和腎小球硬化的分子機(jī)制，尋找減少足細(xì)胞凋亡、蛋白尿的新方法。 7. 建立一支臨床和基礎(chǔ)緊密結(jié)合的多學(xué)科交叉的 2型糖尿病研究梯隊(duì)，并實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)室到臨床（ bench to bedside）的完整對(duì)接； 8. 在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表 100篇以上學(xué)術(shù)論文，并在 Cell、 Nature、 Science 等國(guó)際一流雜志上發(fā)表若干篇論文。開(kāi)發(fā)相關(guān)試劑盒，用于 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的早期監(jiān)測(cè)和早期防治。這部分的研究技術(shù)路線包括：利用已有的大規(guī)模橫斷面和隨訪 513年社區(qū)樣本、 2型糖尿病患者樣本、2型糖尿病家系樣本，結(jié)合已有的糖脂代謝及并發(fā)癥檢測(cè)中的金標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)、以及體力活動(dòng)、飲食習(xí)慣等信息，采用全基因組范 圍外顯子組深度測(cè)序、高通量 SNP檢測(cè)等技術(shù)，運(yùn)用大樣本病例－對(duì)照關(guān)聯(lián)分析、家系關(guān)聯(lián)分析等分析手段，發(fā)現(xiàn)與 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的遺傳因素，并通過(guò)遺傳流行病學(xué)和表觀遺傳學(xué)的分析和研究，闡明遺傳和環(huán)境因素在 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的相互作用。第二部分是以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激等細(xì)胞應(yīng)激為研究切入點(diǎn)，采用基因敲除、轉(zhuǎn)基因、 RNA干擾以及其他分子生物學(xué)技術(shù)，利用代謝組、蛋白質(zhì)組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)研究手段， 并結(jié)合葡萄糖鉗夾等糖代謝病理生理評(píng)價(jià)金標(biāo)準(zhǔn)，在分子、細(xì)胞、整體動(dòng)物和人體組織等層面，研究 2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中胰島 β細(xì)胞受損、肝臟胰島素抵抗的分子機(jī)制；同時(shí)還要研究 2型糖尿病發(fā)展過(guò)程中腎臟和心血管病變的關(guān)鍵分子和作用機(jī)制。 技術(shù)路線： 1. 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中遺傳因素的發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)制研究： 1) 2型糖尿病及并發(fā)癥的易感基因研究：在前期獲得的 2型糖尿病全外顯子組范圍深度測(cè)序信息的基礎(chǔ)上，針對(duì)新發(fā)現(xiàn)的潛在的 2型糖尿病易感基因開(kāi) 展大樣本關(guān)聯(lián)研究。應(yīng)用時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片技術(shù)，開(kāi)展大樣本、高密度 SNP基因型檢測(cè)。 2) 易感基因的功能研 究：我們將進(jìn)一步對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因變異開(kāi)展功能研究。 3) 開(kāi)展糖尿病表觀遺傳學(xué)研究：從已建立的糖尿病和正常血糖者組織庫(kù)中選取年齡、性別，肥胖程度、生活方式等因素匹配的糖尿病患 者和正常血糖者的骨骼肌、脂肪或肝臟組織標(biāo)本。在此基礎(chǔ)上采用 BSP或 MSP技術(shù)，擴(kuò)大樣本驗(yàn)證前期結(jié)果。 4) 開(kāi)展糖尿病與肝癌的機(jī)制研究：從肝癌組織庫(kù)中選取伴有和不伴有糖尿病的肝癌患者腫瘤及癌旁組織標(biāo)本，應(yīng)用 SPSS統(tǒng)計(jì)分析肝癌患者的預(yù)后與糖尿病的關(guān)系；通過(guò)免疫組化方法在組織芯片上檢測(cè)肝癌患者腫瘤微環(huán)境 中 FOXP3，CD68， IL， Th1,Th2和 Th17等因子表達(dá)水平的改變與糖尿病發(fā)生的關(guān)系，明確糖尿病在肝癌進(jìn)展過(guò)程中的作用；應(yīng)用基因芯片進(jìn)行基因組學(xué)研究，篩選伴有糖尿病的肝癌患者的腫瘤及癌旁組織中與肝癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵基因，并在大樣本人群中進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)用生物信息學(xué)手段建立分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以闡明糖尿病影響肝癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制。 5) 研究端粒與糖尿病的關(guān)系：在 3,000例 2型糖尿病與 3000例對(duì)照樣品中進(jìn)行定量 PCR，采用 RNase P這一 2拷貝基因作為內(nèi)參，使用端粒特異性引物擴(kuò)增曲線 Ct值與 RNase P擴(kuò)增曲線的 Ct值的比值（ T/S ratio）衡量每一個(gè)體的端粒長(zhǎng)度。在糖尿病病例中，計(jì)算患病時(shí)間對(duì)端?？s短速度的影響，同時(shí)，分析一些與 2型糖尿病密切相關(guān)的炎性指標(biāo)（如 CRP等）與端粒長(zhǎng)度的之間的關(guān)系。 2. 營(yíng)養(yǎng)因素與 2 型糖尿病的關(guān)系及作用機(jī)制研究： 1) 營(yíng)養(yǎng)、遺傳因素與 2型糖尿病的人群和相關(guān)機(jī)理研究： ? 脂肪酸與 2型糖尿病的 流行病學(xué)研究： 運(yùn)用 氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀（ GCMS）檢測(cè)對(duì) 3210位 參加基線研究的 京滬城鄉(xiāng)居民的紅 細(xì)胞膜的飽和、單不飽和、多不飽（ n3,n6）、以及反式脂肪酸組成和比例，并結(jié)合基線和追蹤研 究收集到膳食 （ 24小時(shí)膳食回顧和過(guò)去 1年的食物頻度問(wèn)卷）和體力活動(dòng)等數(shù)據(jù) ，以及 空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素、 HOMAS、 HOMAB，總膽固醇，LDL和 HDL膽固醇，甘油三脂，以及各種細(xì)胞因子（脂聯(lián)素、視黃醇結(jié)合蛋白 4，抵抗素、 C反應(yīng)蛋白和 IL6）等數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地研究脂肪酸的種類、數(shù)量和比例與炎性反應(yīng)和 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以及膳食結(jié)構(gòu)尤其是脂肪攝入與紅 細(xì)胞膜 脂肪酸種類和比例的關(guān)系。并結(jié)合基線和追蹤研究收集到膳食數(shù)據(jù)、上述糖脂代謝指標(biāo)、以及細(xì)胞因子數(shù)據(jù)，動(dòng)態(tài)地研究營(yíng)養(yǎng)狀況變化對(duì) 2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響。 ? 遺傳關(guān)聯(lián) 分析和基因 營(yíng)養(yǎng)相互作用研究：從 HapMap下載中國(guó)漢族人群的PPARG、 PPARD、 GC、 GYP27B CYP24A CDR、 TMPRSS6和 HFE基因的所有 SNP位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)，選取標(biāo)簽 SNP；采用 TaqMan? SNP基因分型系統(tǒng)，在 3,210普通漢族人群樣本中對(duì)上述 SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，找出若干種中國(guó)漢族人群內(nèi)與 2型糖尿病及其相關(guān)表現(xiàn)型有關(guān)聯(lián)關(guān)系的基因易感位點(diǎn)及其單倍型；分析 PPARG和 PPARD基因的變異與紅細(xì)胞膜脂肪酸的相互作用對(duì) 2型糖尿病及其相關(guān)性狀的影響；分析 GC、 GYP27B CYP24A1和 CDR基因的變異與維生素 D的相互作用對(duì) 2型糖尿病及其相關(guān) 性 狀的影響；分析TMPRSS6和 HFE基因的變異與鐵蛋白的相互作用對(duì) 2型糖尿病及其相關(guān) 性 狀的影響。 ? 在肥胖癥和胰島素抵抗人群及對(duì) 照人群（各 500例）測(cè)定血壓、體質(zhì)指數(shù)、血糖、血脂、血漿炎性細(xì)胞因子、脂肪細(xì)胞因子及胰淀素水平，研究血脂水平、血漿炎性因子水平與胰淀素水平的關(guān)系，以驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 3) 高危人群的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)研究：采用隨機(jī)化對(duì)照，平行試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，將招募到的 300名患有代謝綜合征的志愿者，隨機(jī)分為：（ 1）對(duì)照組：給予不含干預(yù)食物的點(diǎn)心（碳水化合物：脂肪：蛋白質(zhì) =55： 30： 15）；（ 2）亞麻子干預(yù)組：每天食用含有 30克亞麻子的面包；（ 3）核桃干預(yù)組：每天食用 含有 30克核桃的面包。收集干預(yù)前后的膳食，體力活動(dòng)、用藥情況和體格檢查數(shù)據(jù)，以及血樣和尿樣。并采用 ELISA方法測(cè)定胰島素、炎性因子、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激水平指標(biāo)及內(nèi)皮細(xì)胞功能指標(biāo)等。 2) 驗(yàn)證 ChIPDSL 的結(jié)果：針對(duì)部分發(fā)生 2 倍以上變化的靶基因，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)在小鼠胰島 β 細(xì)胞系 MIN6 細(xì)胞中加入脂肪酸，刺激一定時(shí)間后，用FoxO1抗體做染色質(zhì)免疫共沉淀（ ChIP）實(shí)驗(yàn)，初步驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性。采用免疫縈光技術(shù)，觀察在脂肪酸刺激下 MIN6 內(nèi)這些候選基因的表達(dá)量及在細(xì)胞內(nèi)定位改變，合并內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色，觀察這些基因在脂肪酸處理后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位的可能性。 6) 制備其中意義較大基因的轉(zhuǎn)基因及基因敲除小鼠：對(duì)于那些在胰島 β細(xì)胞系和原代分離胰島上參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞凋亡功能明確的基因，建立其 β細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠模型；構(gòu)建成功的小鼠進(jìn)行表型分析，研究