【正文】 顯子）深度測(cè)序信息，就發(fā)現(xiàn)的與 2型糖尿病易感性潛在相關(guān)的變異位點(diǎn)開(kāi)展大樣本關(guān)聯(lián)研究。 4. 將 “組 ”學(xué)研究與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)相結(jié)合，應(yīng)用全外顯子組深度測(cè)序、功能基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究，從整體和宏觀角度闡明 2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。 4) 建立了小鼠高葡萄糖鉗夾試驗(yàn)、小鼠高胰島素 正葡 萄糖鉗夾試驗(yàn) 等技術(shù)平臺(tái) 。 3. 實(shí)驗(yàn)材料與技術(shù)平臺(tái)： 1) 本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)已擁有高水平的基因組、功能基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組、生物信息學(xué)等技術(shù)平臺(tái)，可保證項(xiàng)目順利實(shí)施。還開(kāi)展了腎臟疾病早期預(yù)警的生物學(xué)標(biāo)記的系列研究。 4) 肝臟及脂肪因子與 2型糖尿病、胰島素抵抗的研究方面：中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)并鑒定了一系列新脂肪細(xì)胞因子和肝臟細(xì)胞因子：該團(tuán)隊(duì)報(bào)道了 adiponectin 具有防止脂肪肝的作用；開(kāi)發(fā)了針對(duì)人的介導(dǎo)脂代謝紊亂的因子 AFABP的高度特異性檢測(cè)試劑盒；發(fā)現(xiàn) lipocalin2是介導(dǎo)肥胖相關(guān)的炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗的重要分子，并開(kāi)發(fā)了第一個(gè)用于 lipocalin2檢測(cè)的基于單克隆抗體 的快速免疫檢測(cè)方法；發(fā)現(xiàn) Angptl4 在維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)上具有重要的作用；發(fā)現(xiàn)新肝臟細(xì)胞因子 MUP1 具有增加胰島素敏感性、促進(jìn)能量代謝等作用。曾多次被包括 Nature Review Geics、 Cell、 JAMA、 New Engl J Med 等權(quán)威學(xué)術(shù)雜志論文引用。相關(guān)文章發(fā)表在 Diabetes、 Diabetologia 等糖尿病研究領(lǐng)域重要雜志上。這些詳細(xì)數(shù)據(jù)不僅可保證定性與定量分析需要，而且可以用于分析 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中遺傳因素與生活方式 、營(yíng)養(yǎng)元素之間在是否有交互作用。此外，糖尿病組來(lái)自住院患者，有詳細(xì)用藥情況（降糖、降脂、降壓等用藥詳細(xì)情況）、并發(fā)癥情況（大血管病變、微血管病變 ）、臨床結(jié)局（發(fā)生心血管事件、腎功能衰竭等）等指標(biāo)。 2) 大樣本前瞻隨訪隊(duì)列：上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院、上海市糖尿病研究所在上海曹楊、華陽(yáng)已建立 5年隨訪隊(duì)列（ N＝～ 3,000）。中日友好醫(yī)院牽頭完成了 2022 年全國(guó)糖尿病流行病學(xué)調(diào)查。通過(guò)分析 PERK、 CHOP、ATF BiP等指標(biāo)了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度。采用 RNA 干擾和小分子抑制劑判斷 GLP1發(fā)揮作用的信號(hào)途徑。采用質(zhì)譜分析方法，檢測(cè)這些細(xì)胞的外吐小體中的蛋白質(zhì)水平在病變前后的變化。觀察氧化損傷白蛋白對(duì)血管細(xì)胞 RAS各關(guān)鍵成分（ ACE、 AⅡ 、 AT AT2）表達(dá)的影響。采用 動(dòng) 脈粥樣硬化動(dòng)物模型觀察氧化損傷白蛋白慢性負(fù)荷對(duì)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)及血管活性物質(zhì)合成的作用，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，動(dòng)脈組織勻漿組織因子活性和表達(dá)，以及 PAI1 和抗凝血因子（如 Thrombomodulin）的表達(dá)。并使用 TUDCA主動(dòng)干預(yù)足細(xì)胞 EMT，觀察糖尿病腎病小鼠腎組織病理、尿蛋白、足細(xì)胞凋亡率、足細(xì)胞標(biāo)記蛋白 Nephrin， WT1等、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo) GRP7 GRP94 等、線粒體氧化應(yīng)激指標(biāo)谷胱甘肽 (GSH)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)、錳 超氧化物 歧化酶 (MnSOD)和丙二醛 (MDA)等，線粒體呼吸鏈復(fù)合物 I、 II，一氧化氮合成酶 (NOS) ，細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白 LC3 等、 EMT標(biāo)記物等的變化。利用已構(gòu)建的 UCP2 基因缺失小鼠與配對(duì)的野生型小鼠建立 STZ糖尿病動(dòng)物模型，觀察其足細(xì)胞數(shù)目和足突的變化，以及尿白蛋白和腎功能的變化，同時(shí)比較 2 種小鼠的差異，分析 UCP2 基因缺失對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的影響。根據(jù) AFABP 的蛋白結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)并合成可特異性抑制 AFABP 活性的新型小分子化合物。并 在 前瞻人群中做進(jìn)一步的預(yù)測(cè)驗(yàn)證，最終評(píng)估這些脂肪細(xì)胞因子 /肝臟細(xì)胞因子是否適用于監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展進(jìn)程，將這些疾病的預(yù)防及治療時(shí)間推前。在細(xì)胞水平上，我們將從小鼠分離原代肝細(xì)胞，研究重組 lipocalin2， AFABP 或 /和 adiponectin蛋白對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的直接影響，并研究其信號(hào)通路。分析肝臟脂肪和肝臟胰島素信號(hào)通路傳導(dǎo)；采用 NFκB、 ATF IREPREK、 peLF XBP1特異剪切形式 、 GRP7 JNK等蛋白表達(dá)的定量及活性檢測(cè)分析肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)； 研究 AFABP和 /或lipocalin2在體內(nèi)過(guò)表達(dá)與肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂肪肝和肝臟胰島素抵抗的關(guān)系， adiponectin過(guò)表達(dá)是否可防止上述病變的發(fā)生。 9) 尿酸誘導(dǎo)胰島 β細(xì)胞損傷：設(shè)計(jì)大樣本人群研究，通過(guò)觀察糖代謝、胰 島素分泌及胰島素敏感性等指標(biāo)，進(jìn)一步闡明體內(nèi)高尿酸與細(xì)胞損傷的相關(guān)關(guān)系；利用小鼠原代分離胰島和 β細(xì)胞系 MIN6 觀察不同濃度和處理時(shí)間條件下，尿酸對(duì) β細(xì)胞生存周期、凋亡以及 GSIS的影響。 5) 借助于過(guò)表達(dá)和 RNA 干擾的方法，了解候選基因?qū)σ葝u β 細(xì)胞功能和數(shù)量的影響：構(gòu)建候選基因的過(guò)表達(dá)和干擾腺病毒載體，感染 MIN6 細(xì)胞，觀察這些基因表 達(dá)的增加或缺失對(duì) MIN6 細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌功能以及對(duì)細(xì)胞數(shù)量的影響；過(guò)表達(dá)或者 RNA 干擾候選基因表達(dá)后，加入脂肪酸處理一段時(shí)間，從胰島 β細(xì)胞功能以及細(xì)胞活力兩方面評(píng)估候選基因的功能，希望找到數(shù)個(gè)在脂肪酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性胰島 β細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用的基因。 3. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致胰島 β細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究： 1) 制備內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型，選擇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激小鼠模型：在小鼠胰島 β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞和 ob/ob或者 db/db小鼠原代胰島細(xì)胞中加入脂肪酸或者衣霉素，通過(guò)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 應(yīng)激標(biāo)志分子 CHOP的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，選擇脂肪酸或者衣霉素的處理濃度和時(shí)間，并確定本課題選用的糖尿病模型小鼠的周齡。同時(shí)，根據(jù)美國(guó)心臟聯(lián)合會(huì)（ AHA）推薦的方法對(duì)所有志愿者進(jìn)行膳食和生活方式指導(dǎo)。 2) 血脂、炎性細(xì)胞因子與胰淀素表達(dá)及 2型糖尿病的發(fā)生： ? 利用小鼠胰島 β細(xì)胞株 MIN原代培養(yǎng)的小鼠胰島細(xì)胞通過(guò) Realtime PCR 和 Western blot研究炎性細(xì)胞因子（ TNFα、 MCP1）對(duì)胰淀素表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步利用生化與分子生物學(xué)手段探討 TNFα和 MCP1發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。 ? 維生素與 2型糖尿病的流行病學(xué)研究：運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法、 HPLC電化學(xué)檢測(cè)方法和放射免疫分析分別檢測(cè)紅細(xì)胞膜 B族維 生素，以及血液同型半胱氨酸和 25羥基維生 D的濃度。使用回歸方程對(duì)個(gè)體的端粒長(zhǎng)度與糖尿病發(fā)病之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，在分析中校正年齡， BMI，性別，吸煙狀況等對(duì)端粒有 影響的因素。分析重要靶組織中甲基化差異與基因表達(dá)水平的關(guān)系，以及這些差異與 2型糖尿病發(fā)病的關(guān)系。通過(guò)生物信息學(xué)分析基因變異的出現(xiàn)位點(diǎn)、發(fā)生頻率、 SNP多態(tài)性類(lèi)型以及與下游表達(dá)蛋白之間的關(guān)系；通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子生物學(xué)手段構(gòu)建變異基因發(fā)揮功能的生物大分子，解析其與野生型功能分子之間的差異，從分子水平獲得基因變異所致的功能分子缺陷；最后使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析野生型和變異基因所導(dǎo)致的體內(nèi)表達(dá)譜的整體變化，建立易感基因與疾病發(fā)生關(guān)聯(lián)的完整模型。同時(shí)，以本項(xiàng)目其他課題組新發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞應(yīng)激關(guān)鍵因子為研究對(duì)象，分析基因變異與糖尿病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。同時(shí)在中國(guó)人群中分析脂肪酸種類(lèi)和比例、重要維生素、主要礦物元素等營(yíng)養(yǎng)因素與2型糖尿病的關(guān)系，及其與遺傳因素的交互作用。申請(qǐng) 15－ 20項(xiàng)國(guó)內(nèi)外發(fā)明專利。在糖尿病研究領(lǐng)域，培養(yǎng)一支臨床和基礎(chǔ)緊密結(jié)合、適應(yīng) “轉(zhuǎn)化型研究 ”要求的高級(jí)復(fù)合型人才隊(duì)伍。獲得一批原創(chuàng)性的科研成果，揭示新的 2 型糖尿病干預(yù)和防治靶點(diǎn)。 7. 建立一支臨床和基礎(chǔ)緊密結(jié)合的多學(xué)科交叉的 2型糖尿病研究梯隊(duì)，并實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)室到臨床（ bench to bedside）的完整對(duì)接； 8. 在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表 100篇以上學(xué)術(shù)論文，并在 Cell、 Nature、 Science 等國(guó)際一流雜志上發(fā)表若干篇論文。這部分的研究技術(shù)路線包括：利用已有的大規(guī)模橫斷面和隨訪 513年社區(qū)樣本、 2型糖尿病患者樣本、2型糖尿病家系樣本，結(jié)合已有的糖脂代謝及并發(fā)癥檢測(cè)中的金標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)、以及體力活動(dòng)、飲食習(xí)慣等信息，采用全基因組范 圍外顯子組深度測(cè)序、高通量 SNP檢測(cè)等技術(shù)，運(yùn)用大樣本病例－對(duì)照關(guān)聯(lián)分析、家系關(guān)聯(lián)分析等分析手段，發(fā)現(xiàn)與 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的遺傳因素，并通過(guò)遺傳流行病學(xué)和表觀遺傳學(xué)的分析和研究，闡明遺傳和環(huán)境因素在 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的相互作用。 技術(shù)路線： 1. 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中遺傳因素的發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)制研究： 1) 2型糖尿病及并發(fā)癥的易感基因研究：在前期獲得的 2型糖尿病全外顯子組范圍深度測(cè)序信息的基礎(chǔ)上，針對(duì)新發(fā)現(xiàn)的潛在的 2型糖尿病易感基因開(kāi) 展大樣本關(guān)聯(lián)研究。 2) 易感基因的功能研 究：我們將進(jìn)一步對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因變異開(kāi)展功能研究。在此基礎(chǔ)上采用 BSP或 MSP技術(shù)，擴(kuò)大樣本驗(yàn)證前期結(jié)果。 5) 研究端粒與糖尿病的關(guān)系：在 3,000例 2型糖尿病與 3000例對(duì)照樣品中進(jìn)行定量 PCR，采用 RNase P這一 2拷貝基因作為內(nèi)參，使用端粒特異性引物擴(kuò)增曲線 Ct值與 RNase P擴(kuò)增曲線的 Ct值的比值（ T/S ratio）衡量每一個(gè)體的端粒長(zhǎng)度。 2. 營(yíng)養(yǎng)因素與 2 型糖尿病的關(guān)系及作用機(jī)制研究： 1) 營(yíng)養(yǎng)、遺傳因素與 2型糖尿病的人群和相關(guān)機(jī)理研究： ? 脂肪酸與 2型糖尿病的 流行病學(xué)研究： 運(yùn)用 氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀（ GCMS）檢測(cè)對(duì) 3210位 參加基線研究的 京滬城鄉(xiāng)居民的紅 細(xì)胞膜的飽和、單不飽和、多不飽（ n3,n6）、以及反式脂肪酸組成和比例，并結(jié)合基線和追蹤研 究收集到膳食 （ 24小時(shí)膳食回顧和過(guò)去 1年的食物頻度問(wèn)卷）和體力活動(dòng)等數(shù)據(jù) ，以及 空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素、 HOMAS、 HOMAB，總膽固醇，LDL和 HDL膽固醇，甘油三脂，以及各種細(xì)胞因子（脂聯(lián)素、視黃醇結(jié)合蛋白 4，抵抗素、 C反應(yīng)蛋白和 IL6）等數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地研究脂肪酸的種類(lèi)、數(shù)量和比例與炎性反應(yīng)和 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以及膳食結(jié)構(gòu)尤其是脂肪攝入與紅 細(xì)胞膜 脂肪酸種類(lèi)和比例的關(guān)系。 ? 遺傳關(guān)聯(lián) 分析和基因 營(yíng)養(yǎng)相互作用研究：從 HapMap下載中國(guó)漢族人群的PPARG、 PPARD、 GC、 GYP27B CYP24A CDR、 TMPRSS6和 HFE基因的所有 SNP位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)，選取標(biāo)簽 SNP；采用 TaqMan? SNP基因分型系統(tǒng)，在 3,210普通漢族人群樣本中對(duì)上述 SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，找出若干種中國(guó)漢族人群內(nèi)與 2型糖尿病及其相關(guān)表現(xiàn)型有關(guān)聯(lián)關(guān)系的基因易感位點(diǎn)及其單倍型；分析 PPARG和 PPARD基因的變異與紅細(xì)胞膜脂肪酸的相互作用對(duì) 2型糖尿病及其相關(guān)性狀的影響；分析 GC、 GYP27B CYP24A1和 CDR基因的變異與維生素 D的相互作用對(duì) 2型糖尿病及其相關(guān) 性 狀的影響；分析TMPRSS6和 HFE基因的變異與鐵蛋白的相互作用對(duì) 2型糖尿病及其相關(guān) 性 狀的影響。 3) 高危人群的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)研究：采用隨機(jī)化對(duì)照，平行試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，將招募到的 300名患有代謝綜合征的志愿者，隨機(jī)分為：（ 1）對(duì)照組：給予不含干預(yù)食物的點(diǎn)心（碳水化合物：脂肪：蛋白質(zhì) =55： 30： 15）；（ 2）亞麻子干預(yù)組：每天食用含有 30克亞麻子的面包；（ 3）核桃干預(yù)組：每天食用 含有 30克核桃的面包。并采用 ELISA方法測(cè)定胰島素、炎性因子、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激水平指標(biāo)及內(nèi)皮細(xì)胞功能指標(biāo)等。采用免疫縈光技術(shù)，觀察在脂肪酸刺激下 MIN6 內(nèi)這些候選基因的表達(dá)量及在細(xì)胞內(nèi)定位改變，合并內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色，觀察這些基因在脂肪酸處理后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位的可能性。 8) 糖尿病模型大鼠實(shí)施胃繞道手術(shù)：選擇發(fā)病的糖尿病模型大鼠實(shí)施胃繞道手術(shù)，動(dòng)態(tài)監(jiān)控胃繞道手術(shù)組與假手術(shù) 組的血糖、血胰島素及血脂等各項(xiàng)代謝指標(biāo)；制備胰腺切片， HE染色觀察胰島形態(tài)及大小，免疫縈光實(shí)驗(yàn)分析 Ki67增殖指標(biāo)的變化，胰島素染色觀察胰島 β細(xì)胞在胰島中的比例， CHOP 等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子在胰島 β細(xì)胞中的表達(dá)水平及分布情況， Tunnel 方法觀察胰島β細(xì)胞凋亡率；分離原代胰島，體外進(jìn)行 GSIS實(shí)驗(yàn)，測(cè)定胰島素含量，測(cè)定CHOP等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子的 mRNA和蛋白水平，分析 PDX NueroD、MafA、 GCK等與胰島素轉(zhuǎn)錄及分泌相關(guān)分子的表達(dá)。 4. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝臟胰島素抵抗中的作用： 1) 研究 AFABP, lipocalin2和 adiponectin在肝細(xì)胞應(yīng)激發(fā)生中的作用及其和非酒精性脂肪肝、肝臟胰島素抵抗的關(guān)系：在已建立的 lipocalin2基因敲除、adiponectin基因敲除、 AFABP基因敲除小鼠基礎(chǔ)上，構(gòu)建雙基因敲除小鼠，研究正常及誘導(dǎo)下脂肪肝和胰島素抵抗的發(fā)生、炎癥反應(yīng)的激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。在整體水平上，將利用上述動(dòng)物模型的肝臟標(biāo)本，探討這幾種脂肪因子的單基因或雙基因缺失在正常及肥胖情況下對(duì)肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，將以 UPR反應(yīng)蛋白 GRP78的表達(dá)水平， PERK磷酸化， XBP1 mRNA水平及 JNK激活程度進(jìn)行判定。 3) 評(píng)估脂肪及肝臟細(xì)胞因子作為非酒精性脂肪肝、肝臟胰島素抵抗、糖尿病及其血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè) 和早期診斷價(jià)值： 在課題 1 建立的上海地區(qū) 5年隨訪社區(qū)人群和香港