【正文】 這些基因?qū)σ葝u形成及胰島素分泌功能的影響；觀察胰 島大小及形態(tài)的變化，用 Tunnel 實(shí)驗(yàn)分析胰島 β細(xì)胞的凋亡情況，用免疫縈光技術(shù)對(duì) Ki67 進(jìn)行染色觀察胰島 β細(xì)胞的增殖情況；分離轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠的胰島，觀察胰島在脂肪酸刺激下的葡萄糖刺激的胰島素分泌功能（ GSIS）以及細(xì)胞活力的變化 ，從而了解重要候選基因?qū)﹄x體胰島功能的影響。 8) 糖尿病模型大鼠實(shí)施胃繞道手術(shù)：選擇發(fā)病的糖尿病模型大鼠實(shí)施胃繞道手術(shù)，動(dòng)態(tài)監(jiān)控胃繞道手術(shù)組與假手術(shù) 組的血糖、血胰島素及血脂等各項(xiàng)代謝指標(biāo)；制備胰腺切片， HE染色觀察胰島形態(tài)及大小，免疫縈光實(shí)驗(yàn)分析 Ki67增殖指標(biāo)的變化，胰島素染色觀察胰島 β細(xì)胞在胰島中的比例， CHOP 等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子在胰島 β細(xì)胞中的表達(dá)水平及分布情況， Tunnel 方法觀察胰島β細(xì)胞凋亡率；分離原代胰島，體外進(jìn)行 GSIS實(shí)驗(yàn)，測(cè)定胰島素含量，測(cè)定CHOP等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子的 mRNA和蛋白水平，分析 PDX NueroD、MafA、 GCK等與胰島素轉(zhuǎn)錄及分泌相關(guān)分子的表達(dá)。在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步揭示尿酸造成胰島細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和氧化應(yīng)激的特異性信號(hào)傳導(dǎo)通路，以及各個(gè)相關(guān)因素的之間的相互關(guān)系；建立 β細(xì)胞特異性尿酸受體過(guò)表達(dá)的小鼠模型，通過(guò)經(jīng)腹腔或皮下注射外源性尿酸，在體觀察高尿酸 對(duì) 胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。 4. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝臟胰島素抵抗中的作用： 1) 研究 AFABP, lipocalin2和 adiponectin在肝細(xì)胞應(yīng)激發(fā)生中的作用及其和非酒精性脂肪肝、肝臟胰島素抵抗的關(guān)系：在已建立的 lipocalin2基因敲除、adiponectin基因敲除、 AFABP基因敲除小鼠基礎(chǔ)上，構(gòu)建雙基因敲除小鼠，研究正常及誘導(dǎo)下脂肪肝和胰島素抵抗的發(fā)生、炎癥反應(yīng)的激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。利用脂肪、肝臟、特定神經(jīng)細(xì)胞條件性基因敲除小鼠，研究特定基因（ CPT1A, APPL2， AMPK rGPR11 Ahi等）在脂肪、肝臟以及神經(jīng)細(xì)胞中的缺失對(duì)脂肪及肝臟細(xì)胞因子分泌、能量代謝以及細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路的影響。在整體水平上，將利用上述動(dòng)物模型的肝臟標(biāo)本，探討這幾種脂肪因子的單基因或雙基因缺失在正常及肥胖情況下對(duì)肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，將以 UPR反應(yīng)蛋白 GRP78的表達(dá)水平， PERK磷酸化， XBP1 mRNA水平及 JNK激活程度進(jìn)行判定。 2) 肝細(xì)胞因子 adropin 、 FGF21在調(diào)控脂肪及肝臟 細(xì)胞功能、能量代謝和胰島素敏感性方面的作用：對(duì) FGF21基因敲除小鼠、 adropin基因敲除小鼠模型及其相應(yīng)的野生型對(duì)照組小鼠在經(jīng)過(guò)正常飲食以及高脂飲食喂養(yǎng)后，鑒定其代謝相關(guān)表型，包括糖代謝，脂代謝，脂肪組織功能（例如脂肪儲(chǔ)存、分解，脂肪細(xì)胞因子合成分泌等），分析肝臟的損傷及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。 3) 評(píng)估脂肪及肝臟細(xì)胞因子作為非酒精性脂肪肝、肝臟胰島素抵抗、糖尿病及其血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè) 和早期診斷價(jià)值： 在課題 1 建立的上海地區(qū) 5年隨訪社區(qū)人群和香港地區(qū) 13年隨訪人群中深入研究血清中脂肪細(xì)胞因子（ AFABP, lipocalin2和 adiponectin）以及肝臟細(xì)胞因子（ FGF21和 adropin）水平和肝臟病變發(fā)生的相關(guān)性，并比較上述脂肪細(xì)胞因子 /肝臟細(xì)胞因子的檢測(cè)值與常規(guī)的診斷指標(biāo) (CRP, 糖化血紅蛋白和膽固醇等 )的關(guān)系，以此來(lái)判定這些脂肪及肝臟細(xì)胞因子是否可用于非酒精性脂肪肝、糖尿病以及心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和早期診斷。 4) 肝臟 miR29家族小 RNA在肝臟細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素抵抗發(fā)生中的作用：通 過(guò)高脂飲食飼養(yǎng)正常 C57Bl/6小鼠，或選擇胰島素抵抗小鼠模型（ ob/ob；db/db），通過(guò) HOMAIR分析并確認(rèn)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)后，利用 PAGE/Northern Blot或 Realtime PCR方法研究 miR29家族各成員在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，在肝臟組織中的表達(dá)特征；利用 Western Blot或 Realtime PCR方法進(jìn)一步確認(rèn)可導(dǎo)致胰島 素抵抗的轉(zhuǎn)錄因子 NFκB及其靶基因的表達(dá)特征，分析其和肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)系。 6) 建立基于脂肪 /肝臟細(xì)胞因子和脂肪 肝臟中軸的新藥開(kāi)發(fā)平臺(tái)：使用自行建立的高通量體外檢測(cè)系統(tǒng)篩選可促進(jìn)脂肪細(xì)胞合成 adiponectin、或促進(jìn)肝細(xì)胞合成 FGF21 或 adropin 的化學(xué)小分子。在飲食或遺傳誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中研究其治療效果，在高脂飲食誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因兔模型中進(jìn)行驗(yàn)證。 5. 線粒體氧化應(yīng)激介導(dǎo)糖尿病腎病的作用機(jī)制研究 1) 觀察 STZ導(dǎo)致的糖尿病小鼠動(dòng)物模型中，腎小球足細(xì)胞數(shù)目和足突的變化與UCP2 蛋白表達(dá)變化的關(guān)系。應(yīng)用 RNA干擾技術(shù)抑制足細(xì)胞 UCP2的表達(dá)，檢驗(yàn)誘導(dǎo) UCP2 表達(dá)是否是高糖引發(fā)足細(xì)胞損傷所必需。 2) 運(yùn)用?；切苊撗跄懰幔?TUDCA），從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞水平尋找減少細(xì)胞應(yīng)激介導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡、蛋白尿、細(xì)胞外基質(zhì)（ ECM）積聚，治療糖尿病腎病的新方法。同時(shí)體外培養(yǎng)小鼠腎臟足細(xì)胞，運(yùn)用 westernblotting、 realtime PCR等方法，并通過(guò)流式細(xì)胞儀，觀察 AGEs、高糖、血管緊張素 II、 TGFβ是否導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)的異常變化，并監(jiān)測(cè)足細(xì)胞凋亡率、 LC3II、 αSMA、 Ecadherin、纖維連接蛋白、膠原 I 蛋白的異常變化。 3) 以體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞為對(duì)象，觀察氧化損傷白蛋白對(duì)粘附分子表達(dá)、血管活性物質(zhì)合成及氧 化 應(yīng)激的影響；采用雙室法研究其對(duì)血管內(nèi)皮通透功能的影響并觀察細(xì)胞骨架的變化。通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物模型，研究氧化損傷白蛋白對(duì)血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期的變化（流式細(xì)胞儀法）和細(xì) 胞增殖的改變（ DNA定量） 的影響 ，觀察氧化損傷白蛋白對(duì)血管平滑肌細(xì)胞離子通道（鈣通道，鉀通道）的影響 （膜片鉗法）及其與細(xì)胞內(nèi)離子濃度和細(xì)胞功能的關(guān)系，研究氧化損傷白蛋白對(duì)動(dòng)脈中層厚度和平滑肌細(xì)胞增殖的作用。研究氧化損傷白蛋白對(duì)血管細(xì)胞和單核細(xì)胞作用的受體（ RAGE、各類(lèi)清道夫受體、和 Tolllike receptor）途徑，細(xì)胞氧化應(yīng)激以及 ROS 主要來(lái)源 （ NADPH氧化酶活化），以及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑（ PKCMARKNFκB）。通過(guò)阻斷 RAGE、 NADPH 氧化酶活化等方法，研究抑制氧化損傷白蛋白致血管損傷作用的方法及其對(duì)加速性動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)作用。綜合上述結(jié)果，分析高血糖引起的代謝和氧化應(yīng)激變化，鑒定出高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中線粒體和胞漿產(chǎn)生 ROS的主要途徑和來(lái)源。 2) 選取 2型糖尿病病人和伴發(fā)心血管并發(fā)癥的人群為研究對(duì)象（每組 5060 人）。 3) 開(kāi)展 GLP1用于糖尿病心血管病并發(fā)癥防治的基礎(chǔ)和臨床研究，研究 GLP1對(duì)糖尿病動(dòng)物模型（ ob/ob）和 ApoE（ /）基因敲除動(dòng)物的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的影響，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定活體動(dòng)物心血管指數(shù)的改善情況，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞病理改變，和相關(guān)的氧化應(yīng)激分子表達(dá)的變化。在取得知情同意和通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理的基礎(chǔ)上，開(kāi)展 GLP1隨機(jī)雙盲臨床研究。將采用 8OHG/8OHdG、 SOD、 ROS、 4HNE、 MDA、蛋白羰基化、蛋白酪氨酸硝基化、 AOPP、 AGEs等指標(biāo)分析 DNA/RNA損傷、氧化 /抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)、脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白氧化等變化。 取得重大突破的可行性分析 : 1. 臨床樣本資源及其優(yōu)勢(shì)： 1) 大而全的臨床樣本庫(kù)：上海交通大學(xué)附 屬第六人民醫(yī)院糖尿病研究所自 1996年起，開(kāi)展 “上海糖尿病研究（ Shanghai Diabetes Study） ”“上海糖尿病并發(fā)癥研究（ Shanghai Diabetic Complication Study） ”。并已對(duì)上述人群建立 DNA、血清、尿液等樣本庫(kù)和臨床資料數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)全國(guó)流調(diào)建立了北方病例－對(duì)照人群（ N＝～ 10,000）。整個(gè)項(xiàng)目組的臨床樣本庫(kù)總量超過(guò) 35,000，可以保證有較高的統(tǒng)計(jì)學(xué)效力進(jìn)行易感基因關(guān)聯(lián)分析。香港大學(xué)已對(duì)基線無(wú)糖尿病的人群進(jìn)行了 13年追蹤隨訪（ N＝～ 600）。 3) 具有詳細(xì)的臨床性狀指標(biāo)：上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院、上海市糖尿病研究所的正常血糖對(duì)照組樣本全部來(lái)自社區(qū)流行病學(xué)調(diào)查，臨床指標(biāo)包括：糖脂代謝指標(biāo)（血糖、血脂、胰島素、尿白蛋白 /肌酐比等），體脂指標(biāo)（身高、體重、腰圍、臀圍、體脂百分?jǐn)?shù)等），其他生化指標(biāo)（肝酶、腎功能等） ， 血清脂肪因子水平，飲食習(xí)慣和生活方式 ， 糖尿病家族史 ， 其他疾病史（心血管疾病、血脂紊亂、腫瘤等）等情況。這些為開(kāi)展基于詳細(xì)數(shù)量性狀的分析提供很好的基礎(chǔ)。中科院上海生科院營(yíng)養(yǎng)所 “中國(guó)老齡人口營(yíng)養(yǎng)健康狀況研究 ”的人群具有疾病史、生活方式、心理狀況、膳食資料、人體測(cè)量學(xué)指標(biāo)、糖脂代謝指標(biāo)、各種炎性因子和脂肪細(xì)胞因子，以及鐵蛋白、維生素 D等營(yíng)養(yǎng)元素?cái)?shù)據(jù)。 4) 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院糖尿病研究所在取得醫(yī)學(xué)倫理和知情同意的基礎(chǔ)上，獲得正常人、肥胖者、 2型糖尿病者的肌肉、脂肪等組織樣本，可用于進(jìn)一步驗(yàn)證基礎(chǔ)（細(xì)胞和動(dòng)物）研究結(jié)果。 受 NIH 資助，正在進(jìn)行 2 型糖尿病全外顯子組深度測(cè)序工作。參加本項(xiàng)目的中日友好醫(yī)院牽頭完成了 2022 年全國(guó)糖尿病流行病學(xué)調(diào)查，相關(guān)論文在 New Engl J Med 發(fā)表。已在Circulation、 Diabetes、 Diabetes Care、 AJCN 等國(guó)際心血管、糖尿病和營(yíng)養(yǎng) 科學(xué)領(lǐng)域的權(quán)威學(xué)術(shù)雜志發(fā)表研究論文 30 多篇。 3) 胰島 β細(xì)胞研究方面：南京醫(yī)科大學(xué)、中科院上海生科院在胰島 β 細(xì)胞功能障礙和凋亡機(jī)制、 2型糖尿病與胰島損傷等方面有長(zhǎng)期基礎(chǔ)研究經(jīng)驗(yàn)，在國(guó)內(nèi)擁有最全的胰島 β 細(xì)胞系，成熟的胰島分離技術(shù)及完善的生化和分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)。運(yùn)用 chIPDSL 技術(shù)，已 在小鼠胰島 β 細(xì)胞系中獲得 189個(gè)可能受 FOXO1 直接調(diào)控的靶基因，為本項(xiàng)目的實(shí)施提供了前期工作基礎(chǔ)。最近五年中，在 JCI、 Cell Metabolism、 Circulation、 Diabetes、 PNAS、Gastroenterology、 Hepatology、 Diabetes Care、 European Heart J 等雜志發(fā)表了 70 多篇學(xué)術(shù)論文。 5) 2型糖尿病腎病研究方面：南京醫(yī)科大學(xué)、南方醫(yī)科大學(xué)、中山大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在腎功能不全的發(fā)生機(jī)理，尤其是小管－間質(zhì)纖維化過(guò)程中上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制研究上取得了很好的成績(jī)；首次揭示了腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子機(jī)理及其影響因素，并在蛋白質(zhì)修飾在糖尿病慢性腎臟病發(fā)病的分子機(jī)制、腎功能不全的發(fā)病機(jī)制研究方面有良好的基礎(chǔ)。相關(guān)結(jié)果在 New Engl J Med、 JCI、 JBC、 Hepatology、 Am J Pathol、JASN 等雜志上發(fā)表。相關(guān)文章發(fā)表在 Science、 Nature、 Nat Neurosci、 Am J Hum Ge、 Diabetes 等雜志上。詳細(xì)請(qǐng)見(jiàn) “工作基礎(chǔ)部分 ”。 3) 建立了人體高葡萄糖鉗夾試驗(yàn)（胰島素分泌能力檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)）、高胰島素 正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)（胰島素敏感性檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)）、磁共振波譜法測(cè)定人體肝臟脂肪含量（無(wú)創(chuàng)性肝臟脂肪含量精確檢測(cè)技術(shù)）、磁共振檢測(cè)腹內(nèi)脂肪面積（腹內(nèi)脂肪含量精確檢測(cè)技術(shù)）等臨床技術(shù)。 創(chuàng)新點(diǎn)與特色： 1. 從臨床提出問(wèn)題，將基礎(chǔ)研究與臨床研究緊密結(jié)合，以臨床防治為立足點(diǎn)，從中國(guó)人群的臨床特點(diǎn)出發(fā)，以 2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵組織器官損傷為研究核心，有望發(fā)現(xiàn)適合中國(guó)人群的防治關(guān)鍵，并促進(jìn)基礎(chǔ)研究成果迅速向臨床轉(zhuǎn)化。 3. 充分利用大規(guī)模橫斷面人群、家系樣本和前瞻人群，不僅能從 “靜態(tài) ”角度準(zhǔn)確觀察遺傳、營(yíng)養(yǎng)、炎癥因子等與 2 型糖尿病發(fā)生 發(fā)展的關(guān)系；而且能從 “動(dòng)態(tài) ”角度驗(yàn)證 “靜態(tài) ”研究的結(jié)果。同時(shí)結(jié)合葡萄糖鉗夾技術(shù)（人體、小鼠）以及各種并發(fā)癥、體脂分布的精確評(píng)價(jià)技術(shù)（人體），對(duì)疾病進(jìn)程和變化進(jìn)行精確定位，更準(zhǔn)確的錨定關(guān)鍵分子與表型變化之間的相關(guān)性。 課題設(shè)臵 : 本項(xiàng)目設(shè)臵 6個(gè)課題： 課題 1： 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中遺傳因素的發(fā)現(xiàn)及其功能研究 預(yù)期目標(biāo)： 發(fā)現(xiàn)與中國(guó)漢族人 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的易感基因；闡明細(xì)胞應(yīng)激關(guān)鍵因子遺傳變異與 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；闡明 2型糖尿病發(fā)病過(guò)程中遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用機(jī)制；為 2型糖尿病及其并發(fā)癥易感人群的早期發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。在橫斷面病例 對(duì)照人群以及家系樣本中，闡明基因變異與 2型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，研究遺傳因素與體力活動(dòng)、飲食習(xí)慣等環(huán)境因素相互作用在糖尿病發(fā)生、發(fā)展（并發(fā)癥）中的作用，并在北方人群中驗(yàn)證，同時(shí)在經(jīng) 5年隨訪的大樣本社區(qū)人群中進(jìn)一步驗(yàn)證易感基因?qū)τ谔谴x轉(zhuǎn)歸的預(yù)測(cè)作用。研究細(xì)胞應(yīng)激關(guān)鍵因子遺傳因素與體力活動(dòng)、飲食習(xí)慣等環(huán)境因素在 2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的相互作用。分析變異基因與疾病的關(guān)系及其重要性，解析變異基因?qū)?yīng)生物大分子的晶體結(jié)構(gòu)，構(gòu)建變異基因或?qū)?yīng)蛋白的信息庫(kù)，通過(guò)比較與野生型功能分子之間的差異，獲得易感基因?qū)?yīng)的功能分子缺陷，并研究其缺陷作用機(jī)制及下游體內(nèi)表達(dá)譜的整體 變化，建立易感基因與疾病發(fā)生的有效模型。 4. 表觀遺傳研究：在前期建立的糖尿病和正常血糖者組織庫(kù)中選取年齡、性別 、肥胖程度、生活方式等因素匹配的糖尿病患者和