【正文】 5． 胃上皮細 胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的效應(yīng)分子與調(diào)控機制 胃癌發(fā)生呈明顯的階段性變化，伴隨發(fā)生的分子事件眾多，除可用于診斷和預(yù)警的分子標志物外，本課題組以往的研究還提示存在一些關(guān)鍵的效應(yīng)分子，對這些過程中的關(guān)鍵因素進行阻斷可逆轉(zhuǎn)胃上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化過程，明確這些關(guān)鍵因素有助于提出可用于干預(yù)的關(guān)鍵效應(yīng)因子，達到早期治療的目的。MG 1A COX EGR1/CYR61 是 本項目組以往發(fā)現(xiàn)的重要胃癌早診標志物，但僅依靠單分子的預(yù)告模型無法達到臨床應(yīng)用的目的，利用基因組高通量手段可發(fā)現(xiàn)并鑒定更多的診斷標志物，有助于提出更多、更好的用于分子診斷的策略。因此，進一步明確幽門螺桿菌感染致胃癌發(fā)生的相關(guān)機理，并從分子水平上評價干預(yù)效果，對篩選高危個體、有針對性開展預(yù)防具有重要意義。根除幽門螺桿菌感染能明顯降低重度癌前病變及胃癌的發(fā)病風(fēng)險。 關(guān)鍵標志物的篩選炎性改變癌前病變早期胃癌進展轉(zhuǎn)移致病因素宿主因素異常分子表觀修飾惡性轉(zhuǎn)化惡性表型正常細胞 圖 2 胃癌發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)示意圖 本項目圍繞以上六個與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行胃癌標志物的篩選 （見圖 2），具體科學(xué)問題是： 1．幽門螺桿菌致癌過程中的關(guān)鍵因子 41 幽門螺桿菌可導(dǎo)致胃癌風(fēng)險增高已得到公認，但不同幽門螺桿菌菌株感染，給予宿主的刺激信號不同，導(dǎo)致其致病作用不同，但對何種菌株、那些基因在胃粘膜癌變過程中可引起惡性表型及其具體機制卻有待于明確，同時在此過程密切相關(guān)的幽門螺桿菌特異毒素蛋白的功能及相關(guān)機制也有待闡明，這對闡明幽門螺桿菌相關(guān)性胃癌遺傳標志，對于胃癌高風(fēng)險個體預(yù)警以及幽門螺桿菌有效干預(yù)具有重要意義。 39 項目名稱： 胃癌新標志物的篩選及其預(yù)警和早診作用的 大規(guī)模人群研究 首席科學(xué)家： 樊代明 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué) 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 總后勤部衛(wèi)生部 40 一、研究內(nèi)容 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題包括： 胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多步驟的過程，涉及到大量的分子參與和復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控， 找出其中的關(guān)鍵分子，并確定為胃癌高危預(yù)警、早期診斷和有效治療的生物標志物，是本項目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題 。 第四 年 1． 進一步完善全基因?qū)用娴幕蚪M結(jié)構(gòu)異常檢測和分析技術(shù)，并進行 23 例腫瘤或白血病樣本檢測；其他新型組學(xué)技術(shù)用于白血病研究獲得更多數(shù)據(jù)； 2． 并在較大樣本（ 50100）腫瘤或白血病樣本評價基因組結(jié)構(gòu)異常的頻率，對較高頻率突變基因和結(jié)構(gòu)異常相關(guān)基因進行臨床關(guān)聯(lián)分析，進一步評估突變基因和結(jié)構(gòu)異常相關(guān)基因在疾病發(fā)生發(fā)展中作為診斷指標以及作為靶向治療指標的意義；對較高頻率突變基因和結(jié)構(gòu)異常相關(guān)基因進行深入功能研究，揭示其作為藥物靶標的可能性； 3． 完善生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括 新理論用于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析，建立數(shù)學(xué)模型；尋找和鑒定一批（ 4050）關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)節(jié)點分子，有選擇對一些重要功能基因、節(jié)點分子進行深入研究，探討其作為藥物靶標的可能性；提供一批潛在候選藥物靶標； 4． 新型藥物或治療方案用于少量病人進行實驗研究，觀察治療效果；評價新型診斷指標指導(dǎo)臨床方案的可行性； 5． 在國內(nèi)外一流學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文 710 篇，申請專利 35 項。 第三 年 1． 啟動白血病或腫瘤全 基因組 全基因?qū)用娴幕蚪M結(jié)構(gòu)異常檢測和分析體系 。 第二 年 1． 進一步 完善系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究技術(shù)平臺體系：尤其 全 基因組 外顯子突變檢測和分析技術(shù)；完善 表觀遺傳組等 技術(shù)體系； 初步建立全基因?qū)用娴幕蚪M結(jié)構(gòu)異常檢測和分析技術(shù)體系 。 2）技術(shù)路線： 1. 建立和完善系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究技 術(shù)平臺體系： 除了基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、表觀遺傳組和代謝組等系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)平臺技術(shù)以外，重點發(fā)展基于單細胞的納米分析技術(shù)方法和研究體系，結(jié)合物理學(xué)理論和進化論等，開發(fā)新型生物信息相互作用網(wǎng)絡(luò)和演化的模擬技術(shù)； 2. 建立和完善白血病細胞模型、動物模型、藥物篩選技術(shù)體系以及臨床評價體系： 建立和完善 APL、 AMLM2b 和 CML 相應(yīng)的細胞模型和動物模型以及相應(yīng)的分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和整體評介體系；相關(guān)疾病患者樣本獲取、分離、純化等；建立和完善以復(fù)合細胞模型體系、為對象以生物反應(yīng)為指標的藥靶篩選驗證技術(shù)；建立和完善臨床 治療方案的評價體系等； 3. 白血病細胞生物信息組分解析、相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和動態(tài)演變分析并構(gòu)建數(shù)學(xué)模型： 利用系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究技術(shù)平臺體系對 APL、 AMLM2b和 CML相應(yīng)的細胞模型和動物模型以及患者樣本進行多層次分析，解析其基因組變異以及轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、表觀遺傳組和代謝組等特征；綜合所有“組學(xué)”數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)生物學(xué)分析，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析關(guān)鍵節(jié)點分子，分析疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的動態(tài)演進過程，并構(gòu)建計算機模擬體系和數(shù)學(xué)模型等； 4. 藥物靶標分析和鑒定以及有效藥物作用模式分析： 以 APL細胞模型、動物模型和患者樣本為對象，利用有效藥物如全反式維甲酸和三氧化二砷聯(lián)合方案研究這兩種藥物對 APL細胞分子作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的藥理作用模式，闡明全反式維甲酸和三氧化二砷作為已知靶向治療藥物的作用機制及其毒副作用所涉及的分子及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等；重點以 AML－ M2b細胞35 模型、動物模型和患者樣本為對象，分析天然產(chǎn)物冬凌草甲素和毛萼乙素以及其衍生物對AMLM2b細胞分子作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的藥理作用模式；以 CML（包括急性變）細胞模型、動物模型和患者樣本為對象，基于以上構(gòu)建的生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)設(shè)計新型治療方案，并以 CML（包 括急性變）或 AML－ M2b細胞模型、動物模型和患者樣本為對象，試驗新型治療方案的可行性；基于生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，利用干擾手段包括有效藥物、反義核酸 /RNAi等，分析關(guān)鍵節(jié)點分子作為白血病治療藥物作用靶標的可行性； 5. 基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)原理的新型治療方案設(shè)計和臨床應(yīng)用： 通過對生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析基礎(chǔ)上的新型治療方案設(shè)計如有效藥物的聯(lián)合治療方案，通過充分動物試驗后，對少量合適患者進行應(yīng)用，獲得原理上的證據(jù)（ Proof of concept），為更大規(guī)模推廣奠定基礎(chǔ)。另外，基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究基礎(chǔ)上構(gòu)建 分子信息相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機制，確定關(guān)鍵節(jié)點分子，篩選和鑒定新型白血病治療靶標，為開發(fā)新型藥物奠定基礎(chǔ)。另外 CML 治療雖然有一定進展，如針對 BCRAbl 融合蛋白的 伊馬替尼 (imatinib)有一定效果，但逐漸發(fā)現(xiàn)有耐藥發(fā)生，因此必須發(fā)展其他治療方案，前期研究 基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論設(shè)計新型治療方案， 顯示伊馬替尼 (imatinib)和硫化砷（ arsenic sulfide）合用具有協(xié)同作用。 AMLM2b 型白血病是更為常見的疾病，盡管基礎(chǔ)研究已經(jīng)獲得很大進展，但臨床上 還停留在聯(lián)合化療階段，近年來雖然治療緩解率較高，但復(fù)發(fā)、死亡率仍然居高不下，預(yù)后較差。由于多種遺傳物質(zhì)變異導(dǎo)致了系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)節(jié)調(diào)控機制的失控，并逐漸形成不同于正常造血 細胞的強?。?robustness）的網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控體系，因此必須了解這個新體系中的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成元件以及其相互作用關(guān)系，即解析其生物分子信息的組份，包括基因組變異、表觀遺傳變異、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組成份以及這些分子信息所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機制，利用計算生物學(xué)、物理學(xué)理論并結(jié)合進化論觀點模擬網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化，確定關(guān)鍵節(jié)點分子；并利用干預(yù)手段，包括有效藥物干預(yù)，了解系統(tǒng)的反應(yīng)模式，探討靶向治療、聯(lián)合治療方案和新型藥物開發(fā)的可行性并提供原理上證據(jù)（ Proof of concept）。 5. 在國內(nèi)外一流學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文 3050 篇，出版專著 1－ 2 部，申請專利10－ 20 項。 3. 建立和完善系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)平臺和技術(shù)體系，研究和開發(fā)有自主知識產(chǎn)權(quán)的系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)相關(guān)新技術(shù)、新模型和新理論。 （二）五年預(yù)期目標 : 1. 構(gòu)建白血病 APL 和 AMLM2b 以及 CML 亞型發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中動態(tài)生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，并建立 1種以上白血病亞型的數(shù)學(xué)模型。除完善和發(fā)展基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組學(xué)等高通量“組學(xué)”相關(guān)技術(shù)平臺外，還要研究和開發(fā)基于單細胞分離基礎(chǔ)上的全新研究策略以及蛋白組學(xué)芯片等新技術(shù)、新方法；發(fā)展計算機整合、模擬和疾病數(shù)學(xué)模型構(gòu)建方法；探討物理學(xué)理論、 進化論等應(yīng)用于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究的可行性，為系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中的動態(tài)生物信息相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和數(shù)學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)其關(guān)鍵節(jié)點；并結(jié)合隨機動力學(xué)方程組對白血病細胞所處不同“平衡態(tài)”做出符合系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)的詮釋； 、藥理作用機制詮釋、新型治療藥物發(fā)現(xiàn)和治療方案設(shè)計及臨床轉(zhuǎn)化研究 :利用 APL 細胞模型、動物模型和臨床樣本闡明 其在有效藥物 (全反式維甲酸和三氧化二砷 )處理過程中生物信息相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化，運用系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論深化對 APL 治療藥理作用的全面認識，力爭發(fā)現(xiàn)白血病治療的一般規(guī)律和原理；重點進行 AML－ M2b和 CML 靶向治療的研究，進一步發(fā)展靶向治療的理論 ，研究天然產(chǎn)物冬凌草甲素和毛萼乙素對 AMLM2b 亞型細胞模型和動物模型的治療藥理作用，闡明這二種藥物或其衍生物對致病融合基因 AML1ETO 及其相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機制，為開發(fā)AMLM2b 型白血病新型治療藥物奠定基礎(chǔ)；基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論為 CML 治療設(shè)計新 型治療方案，并探討其臨床轉(zhuǎn)化可行性；同時對生物信息相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵節(jié)點分子進行系統(tǒng)性干預(yù)， 開展藥物靶標篩選 和鑒定 。 8. 力爭獲得低免疫原性、高親和力的 Cyr61 人源化抗體，為 RA 的免疫干預(yù)提供新干預(yù)靶點和手段，并為進入中試生產(chǎn)工藝和臨床研究申報奠定基礎(chǔ)。 6. 了解 RA 相關(guān)炎癥新靶點在 RA 自身免疫發(fā)生中的調(diào)控作用。 3. 闡明 RA 相關(guān) miRNA 分子調(diào)控免疫功能的機制研究 4. 明確可以用于 RA 早期診斷血清生物標志分子及多肽。 （二）預(yù)期目標 1. 通過體內(nèi)和體外實驗篩選理想的負調(diào)疫苗分子。 13. 人源化 RANKL TNF 樣區(qū)單克隆抗體對 RA 模型保護性作用及其機制的研究。 11. 評價雙靶向 HDACi 分子治療 RA 的效果。 8. 對血清生物標志分子及 RA 相關(guān)多肽做為早期診斷靶標的可行性進行研究。 6. 通過對上述 RA 相關(guān)小分子功能研究，合成相應(yīng)的模擬物或抑制劑，分別轉(zhuǎn)染膠原性關(guān)節(jié)炎小鼠動物模型，觀察其對小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)生和炎癥進展的抑制作用。 4. 利用 IL6/IL8 基因敲除小鼠，觀察 Th17 及其炎癥因子、 Cyr61 和 Wnt/DKK1對 CIA 模型的影響。其免疫原性與靶蛋白比較。 第五年度 （一）研究內(nèi)容 1. 體外合成的糖蛋白抗原的生物學(xué)測試。 16. 力爭制備出針對 RANKL TNF 樣區(qū)的人源化單克隆抗體。 27 14. 了解 RA 相關(guān)炎癥新靶點特異性 siRNA 對 CIA 小鼠的治療效果；闡明其發(fā)揮作用的免疫學(xué)機理。 11. 阻斷自身免疫反應(yīng)的激活治療 RA 的實驗研究 12. 了解變構(gòu)肽治療對 CIA 小鼠模型的免疫系統(tǒng)的影響，了解其發(fā)揮作用的免疫學(xué)機理。 9. 明確 RA 患者 Treg 與疾病活動度關(guān)系。 7. 明確 RA 炎癥性 滑膜和骨質(zhì)破壞的新分子和調(diào)控的初步途徑。 5. 了解 RAT 細胞表面膜翻轉(zhuǎn)異位抗原誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性抗體產(chǎn)生的機制，提出新假說。 3. 明確 T 細胞表位特異性應(yīng)答與疾病相關(guān)性。 （二）預(yù)期目標 1. 力爭鑒定出 RA 相關(guān)新型自身抗原。 20. 人源化 RANKL TNF 樣區(qū)單克隆抗體的制備 。 18. 探討使用 RA 相關(guān)炎癥新靶點 siRNA 治療的 CIA 小鼠的病理變化、免疫反應(yīng)特點。 16. 娃兒藤堿類似物 對 CIA 鼠關(guān)節(jié)炎的抑制作用研究 ， 研究小分子化合物在關(guān)節(jié)炎預(yù)防和治療中作用。 14. RA 相關(guān)基因表達差異的研究； RA 特征 miRNA 及分布的研究。分析小分子抑制26 物轉(zhuǎn)染前后 T 細胞內(nèi)相應(yīng)靶蛋白的表達水平。 11. 分析 Cyr6 Wnt/DKK1 途徑對于成骨細胞和破骨細 胞的成長、細胞侵蝕能力、細胞移行能力的影響。 9. 研究 IL17 與 Cyr61 表達對于成骨細胞和破骨細胞的形成與功能的作用。 7. 研究 RAT 細胞表面膜翻轉(zhuǎn)異位抗原誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性抗體產(chǎn)生的機制 。 5. 利用已有的 RA 實 驗動物模型，過繼轉(zhuǎn)移針對活化態(tài) T 細胞的抗體，觀察其治療或者預(yù)防作用。 3. 合成并純化目標表位肽，體外刺激分析其對 T/B 細胞功能的影響。 第四年度 （一）研究內(nèi)容 1. 鑒定與 RA 相關(guān)的新型自身抗原在 RA 發(fā)病過程中的免疫學(xué)特性和功能。 16． 篩選出 RANKL TNF 樣區(qū)相關(guān)的抗原表位。初步評 價針對其得特異性 siRNA 對小鼠 CIA 模型的治療作用。 13． 明確不同亞群 Treg 細胞對初次和再次免疫應(yīng)答的調(diào)控作用研究，及在此作