【文章內(nèi)容簡介】 易感性中的作用及其機制。 2） RA 特征性 SNP 的分布研究。 2．前期組學(xué)篩選基礎(chǔ)上，候選 RA 易感 CNP 及其致病機制研究 3． RA 相關(guān)基因表達(dá)差異的研究 4． RA 特征 miRNA 分布及早期診斷靶標(biāo)研究 5. 血清生物標(biāo)志分子及 RA 相關(guān)多肽做為早期診斷靶標(biāo)的實驗研究 1）雙向電泳 血清蛋白質(zhì)譜鑒定 18 2）血清蛋白指紋圖譜的鑒定及早期診斷靶標(biāo)的實驗研究 3）新型自身抗體篩查研究 經(jīng)費比例： 15% 承擔(dān)單位： 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 常曉天 學(xué)術(shù)骨干： 崔亞洲、潘繼紅、李茹、安媛、劉栩、趙燕 課題 RA 干預(yù)新策略的研究 預(yù)期目標(biāo)： 探討針對 RA 發(fā)病不同環(huán)節(jié)的免疫干預(yù)新方法在膠原性關(guān)節(jié)炎的作用，為RA 免疫干預(yù)新策略研究提供實驗依據(jù)。 研究內(nèi)容： 本課題將在項目組成員既往研究以及本項目前述研究基礎(chǔ)之上，針對 RA 自身免疫反應(yīng)的啟動、調(diào)控、炎癥反應(yīng)及骨破壞等四個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探索 RA 干預(yù)的新策略，并通過與傳統(tǒng)緩解病變抗風(fēng)濕藥（ DMARDs）甲氨蝶呤比較，評價新型免疫治療策略的療效及安全性。 本課題的主要研究內(nèi)容如下： 1. 阻斷自身 免疫反應(yīng)的激活治療 RA 的實驗研究 1） HLADRB1 特異性變構(gòu)肽的優(yōu)化和合成。 2）變構(gòu)肽的體外篩選。 3） HLADRB1 特異性變構(gòu)肽對 CIA 模型的抑制作用。 2. 新型免疫調(diào)節(jié)分子對 RA 自身免疫調(diào)控及治療作用研究 1）娃 兒藤堿類似物的免疫調(diào)節(jié)機制及對 CIA 鼠關(guān)節(jié)炎的抑制作用研究。 2）組蛋白乙?；敢种苿┟庖哒{(diào)節(jié)機制及治療作用研究。 3. RA 相關(guān)新型炎癥靶點及其干預(yù)策略研究 1） 針對靶分子的序列特異性 siRNA 的設(shè)計和篩選。 2）合成的 siRNA 對 CIA 鼠模型的治療作用研究。 4. 新型生物制劑對 RA 骨破壞的抑制作用研究 1） OPGHSP 重組蛋白對 RA 骨損傷和滑膜炎癥的抑制作用研究。 2） RANKL TNF 樣區(qū)疫苗對 RA 骨損傷和滑膜炎癥的抑制作用研究。 19 3）抗 Cyr61 人源化單克隆抗體的制備及對 RA 骨破壞的抑制作用研究。 經(jīng)費比例： 20% 承擔(dān)單位： 首都醫(yī)科大學(xué)、南開大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 趙文明 學(xué)術(shù)骨干： 王鵬、王璞 玥 、李慎濤、沈杰、趙煒、王 煒 20 四、年度計劃 第一年度 （一）研究內(nèi)容 1． 篩選 RA 特異的相關(guān)抗原和表位，并制備相應(yīng)的特異性抗體。 2． 合成 GlcNAc糖蛋白。 3． 進行 T 細(xì)胞糖表位特異性抗體的制備 ，試制糖表位抗體檢測的 ELISA 試劑盒。 4． 分析早期 RA 患者滑膜組織與外周血中自身反應(yīng)性 TCRV 亞家族的表達(dá)。 5． 分析不同抗原 T 表位排列方式對抗原性的影響。 6． T 細(xì)胞二個亞群（ Vγ1/Vγ4）產(chǎn)生 IFNγ 和 IL4 的分子機制研究。 7． 分析 RA 關(guān)節(jié)滑液中 Th17 和 Th1 炎性細(xì)胞亞群格局與相互作用。 8． 分析 RA 局部炎癥與滑液中炎癥因子對于滑膜細(xì)胞的作用，以及 RA 滑膜細(xì)胞所分泌的炎癥因子對于 RA 中 Th1 和 Th17 細(xì)胞的抗凋亡作用。 9． 分析 RA 患者 FLS 中 Wnt/DKK 表達(dá)格局。 10． 分析 FLS 中 Wnt/DKK 不同分子對于 FLS 增殖活化的影響。 11． 析不同 Treg 對 T 細(xì)胞活化的抑制作用，從而評價不同 Treg 亞群對 CIA 免疫應(yīng)答的調(diào)控作用。 12． 從細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞因子分泌等方面，探討 MCSs 對淋巴細(xì)胞的分化的影響。 13． 對 RA 調(diào)控相關(guān)小分子在患者外周血的表達(dá)進行分析。 14． 對項目組前期發(fā)現(xiàn)的 RA 關(guān)聯(lián) SNP 進行進一步基因定位工作，并在大樣本中驗證。同時進行高通量 RA 易感 SNP 的篩選，發(fā)現(xiàn)和鑒定新的 RA 關(guān)聯(lián)基因。 15． 測定篩選出的變構(gòu)肽對 RA 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞活化的影響。 16． HDAC 同功酶的結(jié)構(gòu)計算；合成首批分子。 17． 設(shè)計、合成、篩選，針對 RA 相關(guān)炎癥新靶 點的特異性 siRNA。 18． OPGHSP 重組蛋白的原核表達(dá)、純化、復(fù)性，大量制備。 19． 構(gòu)建原核表達(dá) RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗、 IL17RC 可溶性多肽。 20． 抗 Cyr61 人源化單克隆抗體制備。 21 （二）預(yù)期目標(biāo) 1． 爭取 獲得多個 RA 相關(guān)的新的候選抗原和表位。 2． 研究可用于臨床檢測的 T 細(xì)胞糖表位特異性抗體 RA 診斷方法。 3． 闡明 RA 關(guān)節(jié)滑液中炎癥細(xì)胞亞群及其炎癥因子在 RA 滑膜炎癥的早期作用及相互調(diào)控機制，篩選 RA 炎癥細(xì)胞抗凋亡的調(diào)控機制和新分子。 4． 明確不同 Treg 亞群對 CIA 發(fā)病的不同調(diào)控作用。 5． 闡明 MSCs 對 RA 患者 T 細(xì)胞 功能的影響。 6． 了解 RA 相關(guān)小分子在 RA 患者外周血各免疫細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況。 7． 爭取篩選出新的 RA 關(guān)聯(lián)基因；精確定位多個 RA 關(guān)聯(lián)基因。 8． 力爭獲得與 HLADRB1 結(jié)合力更強，且能抑制 RA 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞活化的新型變構(gòu)肽。 9． 完成 ClassI， ClassIIa， ClassIIb 和 ClassIV 的代表性 HDAC 同功酶的同源模建和結(jié)構(gòu)優(yōu)化工作。 10． 力爭篩選出 針對 RA 相關(guān)炎癥新靶點的特異性 siRNA。 11． 研究 OPGHSP 重組蛋白、 RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗、 IL17RC 可溶性多肽 。 12． 爭取獲得人源化抗 Cyr61 抗體表 達(dá)克隆及穩(wěn)定表達(dá)的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。 第二年度 （一）研究內(nèi)容 1． 利用制備的特異性抗體， 篩選 RA 自身抗原。 2． 合成雙天線型寡糖分子。 3． 研究早期 RA 患者的主要 T 淋巴細(xì)胞。分析不同 T 表位功能表達(dá)的構(gòu)象條件，明確 T 細(xì)胞表位特異性應(yīng)答與疾病相關(guān)性。 4． 糖表位特異性抗體和抗 T 細(xì)胞抗體作用于 RAT 細(xì)胞后導(dǎo)致其表型和功能變化的體外實驗。 5． RAT 細(xì)胞表面抗原性的特點分析。 6． 用 Vγ1 或 Vγ4 特異性抗體對相應(yīng)的 T 細(xì)胞進行體內(nèi)清除，觀察 Vγ1 或Vγ4T 細(xì)胞對關(guān)節(jié)炎的影響。 22 7． 明確炎癥因子 IL17 和相關(guān)炎癥因子對 Cyr61 表達(dá) 的影響和參與滑膜細(xì)胞過度增生的作用。 8． 分析 FLS 中 Wnt/DKK 不同分子對于 FLS 增殖活化的信號調(diào)控途徑。 9． 分析 Cyr61 和 Wnt/DKK 對于滑膜細(xì)胞 MMPs 表達(dá)格局及影響。 10． 研究特定亞群 Treg，對 CIA 模型的關(guān)節(jié)炎形成、體內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生及組織病理改變的作用。 11． 利用 IL10/Foxp3 Tg 小鼠 CIA 模型，探討 MSCs 對小鼠 CIA 發(fā)生發(fā)展的預(yù)防和治療作用。 12． 上調(diào)或下調(diào) RA 相關(guān)小 分子的表達(dá)，分析其對各種免疫細(xì)胞活化及分化功能的影響。 13． 篩選 RA 易感 CNP。 14． 對篩選出的變構(gòu)肽進行豆蔻酸化修飾、鑒定。 15． 進行 首批 HDACi 分子的生物學(xué)測試。 16． 對篩選出的 RA 相關(guān)炎癥新靶點的特異性 siRNA 進行化學(xué)修飾 、 鑒定；同時用其轉(zhuǎn)基因小鼠建立 CIA 模型。 17． 探討 OPGHSP 重組蛋白、 RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗對 CIA 模型的骨損傷防止作用和炎癥反應(yīng)的保護性作用。 18． 在細(xì)胞水平上，研究 IL17RC 可溶性多肽抑制 RANKL 及炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的生物學(xué)功能。 19． 抗 Cyr61 人源化單克隆抗體制備。 （二）預(yù)期目標(biāo) 1． 爭取獲得多個 RA 自身抗原。 2． 通過體外試驗觀察糖表位特異性抗體和抗 T 細(xì)胞抗體對 RAT 細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其機制。 3． 通過體內(nèi)試驗 初步明確 γδT 細(xì)胞二個主要亞群在 RA 中的作用。 4． 明確 Th17 等細(xì)胞及其相關(guān)炎癥因子對于 RA 滑膜炎癥的作用與調(diào)控機制。 5． 分析出不同亞群 Treg 對關(guān)節(jié)炎的預(yù)防作用。 6． 評價 MSCs 對關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展的抑制作用。 7． 明確 RA 相關(guān) 小 分子在 RA 患者外周血各免疫細(xì)胞亞群中的功能。 23 8． 發(fā)現(xiàn) RA 基因組中可能存在的 CNP。 9． 確定豆蔻酸化變構(gòu)肽的免疫學(xué)功能。 10． 優(yōu)化或完善小分子化合物，獲得可選擇性調(diào)控 Treg 亞群分化的系列最佳娃兒藤堿類小分子化合物。 11． 總結(jié)首批測試結(jié)果，建立初步的 RA 和 HDAC 相關(guān)性假說，并將該假說反饋回 HDACi 分 子的設(shè)計和合成。 12． 力爭獲得 12個經(jīng)過化學(xué)修飾而提高體內(nèi)穩(wěn)定性及特異性的針對 RA相關(guān)炎癥新靶點的 siRNA。 13． 獲得利用 RA 相關(guān)炎癥新靶點轉(zhuǎn)基因小鼠建立的 CIA 模型，并了解其發(fā)病前后的各項免疫學(xué)指標(biāo)。 14． 評價出 OPGHSP 重組蛋白疫苗對 CIA 鼠的療效。 15． 闡明 IL17RC 可溶性多肽抑制骨破壞和炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的生物學(xué)功能。 16． 獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)抗 Cyr61 人源化抗體的克隆。 第三年度 （一）研究內(nèi)容 1． 檢測 RA 自身抗原的修飾特點。 2． 進行寡糖分子庫的合成，寡糖芯片的制備和測試。 3． 深入研究 RAT細(xì)胞免疫生物學(xué)特點。 4． 研究 RA患者血清中針對 RAT細(xì)胞的調(diào)節(jié)性抗體的滴度與抗原特異性。 5． 鑒定具有葡聚糖基化修飾的 RAT細(xì)胞膜翻轉(zhuǎn)異位抗原。 6． 分離純化 Vγ1 和 Vγ4 γδT 細(xì)胞，在體外擴增培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至關(guān)節(jié)炎小鼠，觀察不同亞群 γδ T 細(xì)胞對關(guān)節(jié)炎的調(diào)節(jié)作用。 7． 采用小鼠軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，研究阻斷 Cyr61 后對于成骨細(xì)胞生長與維持的影響。 8． 分析 Wnt/DKK 調(diào)控 βcatenin、 RANKL、 OPG 等的表達(dá)和對炎癥因子產(chǎn)生能力和對于成骨細(xì)胞生長的初步影響。 9． 利用從 IL10/Foxp3 Tg 小鼠獲得的不同亞群 Treg細(xì)胞，探討不同亞型 Treg對 CIA 動物模型的治療作用。 10． 分析 RA 患者外周血 Treg、 Th Th17 分布，探討 Treg 分布變化與 Th24 Th17 分布的相關(guān)性。 11． 檢測 MSCs 治療 CIA 模型 IL10/Foxp3 Tg 小鼠血清細(xì)胞因子水平，并分離小鼠脾細(xì)胞，分析各 T 細(xì)胞亞群的數(shù)量、細(xì)胞表型及體外活化功能。 12． 采用基因表達(dá)芯片比較上調(diào)或下調(diào) 小分子 表達(dá)后， 其在 相應(yīng)免疫細(xì)胞表達(dá)譜的差異，尋找差異表達(dá)的 RA 相關(guān)小分子 。 13． 對上述研究中發(fā)現(xiàn)的 RA 關(guān)聯(lián)基因和 CNP 的作用機制進行研究。 14． 使用前述經(jīng)優(yōu)化設(shè)計并篩選出的變構(gòu)肽對 HLADRB1轉(zhuǎn)基因小鼠的 CIA模型進行治療，綜合評價其治療效果。 15． 檢測小分子化合物對 CII 免疫后不同階段 CIA 小鼠中 Treg 亞群數(shù)量，格局和功能的改變。 16． 優(yōu)化 HDAC同功酶的結(jié)構(gòu)，預(yù)測 HDAC與先導(dǎo) HDACi分子的結(jié)合模式；合成第二批 HDACi分子。 17． 利用 siRNA 檢測下調(diào) RA 相關(guān)炎癥新靶點對 RA 細(xì)胞炎性反應(yīng)及自身抗原的免疫反應(yīng)的作用。觀察其 siRNA 對 CIA 的治療效果及對小鼠的影響。 18． 體外實驗研究 OPGHSP 重組蛋白防治骨破壞和抑制炎癥反應(yīng)的作用機制。 19． 探討 RANKL TNF 多肽疫苗發(fā)揮保護性效果的作 用機制。 RANKL TNF 樣區(qū)表位的篩選。 20． 制備足量抗 Cyr61 人源化單克隆抗體，并用于小鼠 CIA 模型和體外細(xì)胞實驗體系的治療實驗 （二）預(yù)期目標(biāo) 1． 闡明獲得的修飾抗原是否具有特異的修飾以及相應(yīng)的修飾特點。 2． 系統(tǒng)分析其 TCR 特異性、表達(dá)水平以及 ZAP70 等信號途徑改變。 3． 明確 RA 患者體內(nèi)糖表位特異性抗體和抗 T 細(xì)胞抗體與疾病的相關(guān)性。 4． 成功鑒定 RAT 細(xì)胞膜表面葡聚糖基化修飾的膜翻轉(zhuǎn)異位抗原。 5． 了解不同亞群 T 細(xì)胞對關(guān)節(jié)炎的調(diào)節(jié)作用。 6． 明確 Th17 及其相關(guān)調(diào)控因子如 Cyr61 和 Wnt/DKK 對于 RA 滑膜炎癥和引起 骨質(zhì)破壞的現(xiàn)象。 7． 分析出不同亞群 Treg 對關(guān)節(jié)炎的治療作用。 8． 闡明調(diào)節(jié)性和致病性 T 細(xì)胞之間比例失衡在 RA 發(fā)病機制中的作用 25 9． 分析間充質(zhì)干細(xì)胞對 T 細(xì)胞調(diào)控作用機制。 10． 明確差異表達(dá)的 RA 相關(guān)小分子 ，并預(yù)測出 可能的 作用靶點。 11． 力爭篩選出多個 RA 關(guān)聯(lián)基因和 CNP，闡明其致病機制。 12． 確定經(jīng)前述篩選獲得的變構(gòu)肽對 CIA 的實際治療效果。 13． 明確不同亞群 Treg 細(xì)胞對初次和再次免疫應(yīng)答的調(diào)控作用研究，及在