【正文】 。 另外，對(duì)于基因工程產(chǎn)品，還應(yīng)注意生物安全 (biosafety)問(wèn)題，即要防止菌體擴(kuò)散，特別對(duì)前面幾步操作，一般要求在密封的環(huán)境下操作。 目前認(rèn)為，基因工程產(chǎn)品的回收率達(dá)到 40％就已相當(dāng)不錯(cuò)。而且發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度也較稀，雜質(zhì)又多，加上一般大分子較小分子不穩(wěn)定 (如對(duì)剪切力 )，故提取較困難，常需利用高分辨力的精制方法，如色層分離等。 (2)基因工程產(chǎn)品大多處于細(xì)胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎，增添了很多困難。估計(jì)能達(dá)到大量培養(yǎng)重組菌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則中 LS— LS2 等物理性密封試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。例如，菌體的分離通常使用沙氏 (Sharpres)型離心機(jī)；由于很可能產(chǎn)生氣溶膠，故用膜分離法進(jìn)行濃縮。此外，必須設(shè)置警報(bào)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)罐壓力， 以免發(fā)生異常。 可是實(shí)際操作者必須小心謹(jǐn)慎，否則難以防止因疏忽而造成的重組菌的擴(kuò)散。重組菌培養(yǎng)罐中，凡有可能外漏重組菌的部分都與排污管道相連。如果排液口未與下段工序相連那就應(yīng)與連結(jié)廢液滅菌罐的排水管道相接，這樣就安全了。 6，排液 培養(yǎng)后要將培養(yǎng)液輸送至貯罐等下一道工序，這時(shí)也有可能產(chǎn)生氣溶膠和重組菌的擴(kuò)散。簡(jiǎn)單的安全接種法是將種子瓶與培養(yǎng)罐以管相連接后，用無(wú)菌空氣加壓壓入的方法。取樣、排液的管道中能產(chǎn)生這類(lèi)排水，因此，一定要另行安裝排水管并與廢液滅菌貯槽等相連接，以便徘放污水。取出的樣品保存于冷庫(kù)內(nèi)，冷庫(kù)內(nèi)的空氣經(jīng)濾器過(guò)濾，內(nèi)部也可進(jìn)行滅菌。取樣方法與人工取樣程序大致相同。為了減少操作人員接近工程菌的機(jī)會(huì)，盡量不用人工操作而采用自動(dòng)取樣裝置最為安全。例如，通過(guò)雙層橡皮膜，用注射器取樣；把可移動(dòng)的完全密封型的球形箱與取樣管連接，在此箱中取樣等。取樣中使用的排水管管道與廢液滅菌貯罐相連，取樣及滅菌時(shí)產(chǎn)生的排水一并貯存于罐內(nèi)，經(jīng)滅菌后排出。取完所需的樣品，卸下之前對(duì)取樣管道再次滅菌。此法可在培養(yǎng)液不接觸外界的條件下取樣。取樣后對(duì)樣品管道滅菌時(shí)，未滅菌的培養(yǎng)液污水被排至排水管內(nèi)?，F(xiàn)時(shí)，基因重組菌的培養(yǎng)罐仍采用雙機(jī)械密封的上攪拌方式為多，其次用雙機(jī)械密封 的下攪拌方式。 10L 以下的培養(yǎng)裝置以往一直是用磁力進(jìn)行動(dòng)力傳動(dòng)的，但罐一大，會(huì)出現(xiàn)磁力不足、軸承磨損等問(wèn)題。但若考慮培養(yǎng)液外漏的情況，培養(yǎng)基因重組菌時(shí)，以用上部攪拌的雙機(jī)械密封為好。因此，問(wèn)題在于攪拌軸是由罐的上部還是下部通入。這時(shí)，上、下兩部分即使有一部分的密封液滲漏，培養(yǎng)液也幾乎無(wú)外 漏危險(xiǎn)。所以單機(jī)械密封的培養(yǎng)罐不宜用于基因重組菌的培養(yǎng)。這是培養(yǎng)結(jié)束后滅菌時(shí)最易外漏的所在。這樣一來(lái)，即便正常運(yùn)轉(zhuǎn)，培養(yǎng)液也會(huì)一點(diǎn)一點(diǎn)地滲入密封面，很有可能經(jīng)此流出。前者由單密封面將罐與外界隔開(kāi)。 2，機(jī)械密封 通氣攪拌培養(yǎng)罐中貫穿罐的攪拌軸須與傳動(dòng)部連接。使用膜濾器時(shí)，因?yàn)V器表面凝結(jié)水汽，壓力損失驟增，深度型濾器除菌效率也會(huì)因水汽凝結(jié)而下降。后者主要用于氣體過(guò)濾，其原理與膜濾器不同，無(wú)篩網(wǎng)的效果，而是通過(guò)靜電吸附、慣性沖撞等作用捕集氣體中的粒子。除菌濾器與培養(yǎng)罐空氣入口處的相同。C。為減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)量和降低排氣的相對(duì)濕度。C 時(shí)，均末在膜濾器上檢出大腸桿菌和酵母菌。使用藥劑時(shí)若能在排氣鼓泡瓶?jī)?nèi)進(jìn)行攪拌、消泡的話，是會(huì)有效果的。表中數(shù)字為培養(yǎng)開(kāi)始啟 12h 中在膜濾器上捕集到的活菌數(shù)。電熱器之后附有冷凝器，旨在使高溫的排氣冷卻，以防膜濾器燒毀。用電熱器對(duì)排氣進(jìn)行加熱時(shí)，在電熱器出口處的排氣溫度被控制在 200176。 另外，為了解加熱能否對(duì)排氣滅菌，進(jìn)行了與上述類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)。氣體通過(guò)排氣管到鼓泡瓶，再通過(guò)膜濾器?？傊艢膺^(guò)程中含有相當(dāng)多的菌。由此可見(jiàn)，雖然培養(yǎng)液中菌體濃度相差很大，但大腸桿菌和酵母菌仍以幾乎相同程度從排氣中漏出，并不取決于菌體個(gè)體的大小。有人試驗(yàn)證明，排氣中的微生物數(shù)量隨著培養(yǎng)液中菌體濃度和通風(fēng)速度等而變化。它們從排氣口向外排出，重組菌也容易隨之外漏?，F(xiàn)分別說(shuō)明如下。歸納起來(lái)有： (1)排氣， (2)機(jī)械密封， (3)接種， (4)取樣， (5)培養(yǎng)后的滅 菌 (通入濕熱蒸氣 )，(6) 排液 (輸至下一工序 )。但培養(yǎng)罐稍大，該法就難以使用了。前者是可移動(dòng)的臺(tái)式，罐本身不能承受高壓；后者，蒸汽、空氣等供給是用固定管道連接的，一般不能移動(dòng)；這兩類(lèi)罐要充分考慮不使微生物由罐外進(jìn)入罐內(nèi)的問(wèn)題，但并不一定要解決防止罐內(nèi)微生物的外漏問(wèn)題。 現(xiàn)今使用的微生物培養(yǎng)裝置，按其滅菌法又可分兩類(lèi)。 一、培養(yǎng)裝置 作為基因重組體的培養(yǎng)裝置，與一直沿用的通氣攪拌培養(yǎng)罐要有區(qū)別，即不僅要防止外部微生物侵入罐內(nèi)，還必須采用不使培養(yǎng)物外漏的培養(yǎng)裝置。在進(jìn)行以工業(yè)化為目的的 DNA重組實(shí)驗(yàn)，以及為生產(chǎn)異種基因產(chǎn)物而培養(yǎng)重組菌 時(shí)，當(dāng)然應(yīng)采用簡(jiǎn)便易行的培養(yǎng)系統(tǒng)。 由此可知，在基因工程細(xì)胞培養(yǎng)工程中，需根據(jù)其固有特點(diǎn)和具體情況，采取相應(yīng)措施、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，增加質(zhì)?？截悢?shù)，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)條件優(yōu)化，提高表達(dá)效率。過(guò)濾達(dá) 15min后培養(yǎng)液中已測(cè)不出色氨酸，表達(dá)效率增加， β半乳糖苷酶活力劇增。 此外，當(dāng)質(zhì)粒拷貝數(shù)與某些化合物有關(guān)時(shí)，亦可采取添加或去除相應(yīng)化合物的雙階段連續(xù)過(guò)濾培養(yǎng)法以提高拷貝數(shù)和表達(dá)效率。再將培養(yǎng)溫度提高至 37℃，則質(zhì)?？截悢?shù)增加，基因產(chǎn)物 β內(nèi)酰胺酶活性增加 37 倍左右，但 Fn急劇下降。在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達(dá)到提高拷貝數(shù)目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細(xì)胞負(fù)荷，此時(shí)拷貝數(shù)較低，而比生長(zhǎng)速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質(zhì)?？截悢?shù)增加，目的基因產(chǎn)量提高。 3，表達(dá)效率及質(zhì)?？截悢?shù)控制 在基因工程細(xì)胞培養(yǎng)工程中，表達(dá)效率與質(zhì)?？截悢?shù)有關(guān)。而在有選擇壓力下，則可獲得穩(wěn)定狀態(tài)。 由圖 720 可知．假定 P＝ 1%，當(dāng) α＝ 0 時(shí)，表明質(zhì)粒丟失菌株不能生長(zhǎng)，培養(yǎng)處于最理想的穩(wěn)定狀態(tài)，亦為質(zhì)粒最穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí) Fn 接近于 ；但在無(wú)選擇壓力下， α值越大， Fn越低，即質(zhì)粒穩(wěn)定性越差。 為考察質(zhì)粒穩(wěn)定性，在此引入質(zhì)粒保持率 Fn的概念， Fn表示分批培養(yǎng)中細(xì)胞分裂 n次后，培養(yǎng)液中基因工程細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的 比值，即 假定在分批培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期每次分裂時(shí)，其質(zhì)粒丟失率為 P，則 Fn為： 式中 α 質(zhì)粒丟失菌株與質(zhì)粒保持率菌株 μ 的比值； n細(xì)胞分裂次數(shù) 理論上基因工程菌載荷外源性基因，培養(yǎng)過(guò)程細(xì)胞大量合成外源性產(chǎn)物，其負(fù)荷大于質(zhì)粒丟失菌株，故基因工程菌株比生長(zhǎng)速率 μ 通常較質(zhì)拉丟失菌株小，當(dāng)然亦有變化不大者。只有在 Sm存在下宿主才能生長(zhǎng)，但重組質(zhì)粒上含有 Sm非依賴性 (Smid)基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，所獲克隆菌可在不含抗生素培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而丟失質(zhì)粒菌株卻不能生長(zhǎng)。為此考慮采用抗生素依賴性變異法替代抗生素添加法。 質(zhì)粒穩(wěn)定性 重組質(zhì)粒上通常載有 Apr 基因，獲得該類(lèi)重組質(zhì)粒的基因工程菌在含氨芐青霉素培養(yǎng)液中可以生長(zhǎng)，而非基因工程菌不能生長(zhǎng)。但菌體對(duì)葡萄糖及氨基酸的收率因培養(yǎng)條件而異，如以葡萄糖及分別用蘇氨酸、亮氨酸、組氨酸及色氨酸為底物時(shí)，則平均每克底物所獲干菌體量分別為 、 、 1 40 及 40g 。培養(yǎng)過(guò)程細(xì)胞對(duì)維生素需求量甚微，在培養(yǎng)開(kāi)始即加入必需量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)并無(wú)影響，但培養(yǎng)一開(kāi)始即加入足夠量氨基酸則可能因氨基酸濃度過(guò)大而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。根據(jù)這些結(jié)果采用枯草桿菌不太合適，除非其具有產(chǎn)物的高效分泌系統(tǒng)。 1，底物濃度的控制 在基因工程茵培養(yǎng)過(guò)程，至少要遵循 PI級(jí)物理防護(hù)的規(guī)定，因此必需進(jìn)行菌體的高密度培養(yǎng)。 目前關(guān)于動(dòng)植物基因工程細(xì)胞培養(yǎng)工程的研究剛剛起步，有待進(jìn) — 步發(fā)展。至于影響基因工程細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生物量得率與產(chǎn)物量的因素及有關(guān)參數(shù)。由此可見(jiàn)，在基因工程細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，除 — 般培養(yǎng)條件外，必需考慮基因工程細(xì)胞的自身特點(diǎn)，確定最佳培養(yǎng)條件。此外，基因工程細(xì)胞的原宿主通常是某些培養(yǎng)物質(zhì) (如某種氨基酸或維生素等 )的缺陷型，有些基因工程細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程亦產(chǎn)生某些抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝物。因此，基因工程細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，重組 DNA 的丟失方式亦有兩種，其一是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，由于回復(fù)突變或分配作用致使 DNA 丟失．稱(chēng)為脫落性不穩(wěn)定，其二是重組 DNA 中編碼的結(jié)構(gòu)基因在宿主內(nèi)發(fā)生再重組過(guò)程產(chǎn)生突變，不再表達(dá)目的產(chǎn)物，此稱(chēng)加結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定。實(shí)踐表明，基因工程細(xì)胞工業(yè)化培養(yǎng)中 ，產(chǎn)物的產(chǎn)率往往比實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)規(guī)模為低。 二、基因工程細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn) 前已述及，基因工程細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程與培養(yǎng)方式與天然細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程或方式基本— 致。設(shè)計(jì)用于基因重組菌的培養(yǎng)裝置時(shí)，不僅要考慮外部雜菌的侵入，還要防止重組菌的外漏。 LS2 相當(dāng)嚴(yán)格，工業(yè)生產(chǎn)起碼應(yīng)在 LS1 的設(shè)備標(biāo) 準(zhǔn)下培養(yǎng)。按密封程度分 B1 和 B2 級(jí)，B2 級(jí)的密封要求最嚴(yán)格。密封程度分為 P P P3 和 P4 級(jí)，數(shù)字越大，密封水平越高。 物理密封是將