【正文】 感謝給我?guī)椭膶W(xué)姐學(xué)長呂恒、趙喬明等，還要感謝跟我一起實(shí)驗(yàn)的趙鋒、盧慧兵同學(xué)。無論在學(xué)習(xí)上還是生活中，導(dǎo)師在我身上傾注了大量心血，我的學(xué)有所獲離不開她的關(guān)心和照顧，杜老師孜孜不倦、意味深長地教誨猶記耳邊，在此向?qū)煴硎居芍缘刂x意 ! 回想往事，如果沒有那么多熱心的老師和同學(xué)們的幫助和支持，我的學(xué)位論文難以完成，感謝以下老師和同學(xué)。 液體菌種栽培以其特有的菌種流動(dòng)性好、接種后易于分散、污染幾率小、菌絲萌發(fā)快、發(fā)菌點(diǎn)多、出菇時(shí)間短而整齊等特點(diǎn)，越來越受到廣大學(xué)者的關(guān)注，該方面的研究日益加深，從杏鮑菇適宜液體菌種栽培 的菌 株選 育到杏 鮑菇 液體 菌種栽 培條 件研 究， 乃至胞 外酶活性、深層發(fā)酵，但關(guān)于篩選杏鮑菇液體菌種 最佳培養(yǎng)周期的研究還比較少 。我們 正處在一個(gè)特定的發(fā)展時(shí)期，農(nóng)村勞動(dòng)力 需要大量轉(zhuǎn)移而 傳統(tǒng)的杏鮑菇栽培方式需要大量的勞動(dòng)力。在食用菌的國際貿(mào)易中，我國的貿(mào)易量占到亞洲的 80％，占到全球的 40％。香港中文大學(xué)國際食用菌生物技術(shù)中心主任張樹庭認(rèn)為，近年中國的食用菌產(chǎn)量雖不斷增加，但出口數(shù)量所占的比例卻在下降，其中雖有綠色壁壘問題，但關(guān)鍵是隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，杏鮑菇越來越多的受到消費(fèi)者的青睞，生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大為 大眾食用菌產(chǎn)品，其傳統(tǒng)的生產(chǎn)模式已不能滿足市場的需要。二是生產(chǎn)過程缺乏標(biāo)準(zhǔn)。這主要表現(xiàn)在生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的不規(guī)范，從而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定甚至低下。而液體菌種不同培養(yǎng)期對菌種各項(xiàng)指標(biāo)影響巨大，探討最佳培養(yǎng)周期無疑具有巨大意義。從營養(yǎng)生長和生殖生長兩階段的關(guān)系來說，前者為后者提供營養(yǎng)物質(zhì)， 只有積累足夠的營養(yǎng)并達(dá)到生理成熟，方可順利出菇，并獲得較高的產(chǎn)量和較好質(zhì)量。所以在此條件下第六天接種能顯著縮短杏鮑菇萌發(fā)出菇時(shí)間，縮短栽培周期，獲得較大經(jīng)濟(jì)利益。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果：菌球直徑在第六天最??；菌球密度在第六天最大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果：淀粉酶活性在第 57 天內(nèi)達(dá)到最大；羧甲基纖維素酶活性在第六天達(dá)到最大；多酚氧化酶活性在 68 天內(nèi)很大；漆酶在第六天內(nèi)達(dá)到最大。 杏鮑菇液體菌種最佳培養(yǎng)周期的研究 14 漆酶活性 變化 從液體菌種培養(yǎng)第三天起每天上午用分光光度計(jì) 在 600nm 處 測定漆酶活性，以 OD 值表示 ，試驗(yàn)結(jié)果見圖 7。在前四天多酚氧化酶保持較低活性，第四天以后 多酚氧化酶的分泌量 呈 梯級上升， 隨后加速分泌，第七天達(dá)到分泌高峰， 最高為 ， 而后又呈梯級下降。杏鮑菇優(yōu)先分解利用纖維素，纖維素消耗完后開始分解利用半纖維素。但在第九天又出現(xiàn)回升趨勢。后期隨著多糖的消耗，淀粉酶分泌減少，活性降低。杏鮑菇液體菌種在 13 天內(nèi)淀粉酶活性很低，維持在 以下，在 45 天淀粉酶活性迅速增大， 在第五天淀粉酶活性已達(dá) ，在 57 天內(nèi)淀粉酶維持較大活性 （ ），最大活性出現(xiàn)在第六天，最大為 。但當(dāng)培養(yǎng)基 pH 在 以下時(shí)菌種開始生長不良。所測結(jié)果 見圖 3。培養(yǎng)初期，培養(yǎng)基內(nèi)物理化學(xué)性狀較適合菌種生長菌種開始大量增殖，菌球密度快速增加。 013 4 5 6 7 8 9Trianing daysFungus ball diameter（mm）0 0 圖 1 杏鮑菇液體菌種菌球直徑變化曲線 Figure 1 Pleurotus eryngii fungus ball diameter liquid strain curve 不同培養(yǎng)時(shí)間下的菌球密度變化 從液體菌種培養(yǎng)第三天起每天上午在超凈工作臺上吸取 1ml 培養(yǎng)液放入培養(yǎng)皿中，觀察菌球個(gè)數(shù) ，試驗(yàn)結(jié)果見圖 2。菌球直徑越小說明液體菌種流動(dòng)性越強(qiáng)，菌種生長越迅速。 3 結(jié)果與分析 不同培養(yǎng)時(shí)間下的菌球直徑變化 從液體菌種培養(yǎng)第三天起每天上午在超凈工作臺上吸取 1ml 培養(yǎng)液放入培養(yǎng)皿中，取 20 個(gè) 菌球排成一列，測總長度，然后計(jì)算單個(gè)菌球直徑 [21]。 培養(yǎng)基 pH 的測定 用玻璃棒蘸取少量培養(yǎng)基浸濕精密 pH 試紙，與標(biāo)準(zhǔn)比色卡對比讀數(shù)。 多酚氧化物酶活性測定 先往試管中加入 ， ph= 的磷酸鹽緩沖液 ，再加入 ，再加稀釋 10 倍的 粗酶液 ，28℃ 保溫 30min，測 400nm 處 OD 值，以煮沸滅活 15min 的酶液作對照（設(shè)置三個(gè)重復(fù)）。 淀粉酶活性的測定 在試管加入 %可溶性淀粉溶液（ 、 沖液） ，再加入稀釋 10 倍粗酶液 ，混勻，于 38℃ 水浴保溫 30min，取出后立即加入 DNS 試劑 ，煮沸 5min 后取出，冷卻后加入蒸餾水 ，混勻，測 520nm 處 OD 值，以煮沸滅活 15min的酶液作對照 [ 20]（設(shè)置三個(gè)重復(fù)）。 測定方法 菌球直徑的 測定 取 lml 培養(yǎng)液放入培養(yǎng)皿中，按 lml培養(yǎng)液含菌球大小的數(shù)量比，取 20 個(gè)菌球在培養(yǎng)皿中排成一列，測總長度，然后計(jì)算單個(gè)菌球直徑，取 3 次求平均值 [19]。 DNS 試劑配制 ：酒石酸鉀鈉 ，溶于 50ml 蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入 3， 5二硝基水楊酸 ， ，苯酚 ，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至 100ml，貯于棕色瓶中，室溫保存。 一級菌種的制備 ： 母種活化將保存的菌種轉(zhuǎn)接到無菌的斜面培養(yǎng)基上，放入 25℃ 左右恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 7— 10 天，得到斜面母種。配制方法：現(xiàn)將馬鈴薯洗凈去皮， 再稱取 200g 馬鈴薯切成小塊， 加水煮爛。 所需藥品 葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，維生素 b，蒸餾水 , 醋酸，醋酸鈉，羧甲基纖維素鈉，可溶性淀粉，酒石酸鉀鈉， 3， 5二硝基水楊酸，苯酚，氫氧化鈉，磷酸氫鉀，鄰聯(lián)甲苯胺 ，鄰苯二酚等。 但是液 體菌種 質(zhì)量 是影 響萌發(fā)出河南科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 5 菇的關(guān)鍵因素之一 ，采用質(zhì)量好的菌種無疑能提高出菇產(chǎn)量。對杏鮑菇的菌種進(jìn)行液體培養(yǎng)，單位體積液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)菌絲速度快，生產(chǎn)量大，只需 4— 5 天即可生產(chǎn)幾升到幾十升甚至更多。一些小型食用菌生產(chǎn)廠家和一般菇農(nóng)很難生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的液體菌種應(yīng)用于生產(chǎn)。雖然有資料表示液體菌種在 04℃ 保存2— 3 個(gè)月仍可作菌種，但也有試驗(yàn)顯示液體菌種 04℃ 保存超過 3天，菌種的生活力就有所下降，萌發(fā)慢，菌袋易污染。 1979 年上海師院的楊慶堯教授開始對香菇、金針菇等培養(yǎng)液體菌種，并進(jìn)行栽培試驗(yàn)。 國外 杏鮑菇液體菌種 研究現(xiàn)狀 20 世紀(jì)中期，微生物液體深層培養(yǎng)（發(fā)酵）技術(shù)迅猛發(fā)展，從而形成了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、食品發(fā)酵工業(yè)。 液體菌種整個(gè)生產(chǎn)過程都是在一個(gè)罐體內(nèi)完成，按鍵操作，既成倍降低了生產(chǎn)、管理費(fèi)用，又節(jié)省人工，輕松制種。 用液體菌種無論是生產(chǎn)栽培種還是栽培袋，其菌種成本就 2－ 3 分錢。 液體菌種生產(chǎn)需經(jīng)過篩 選、提純，屬純菌種；在生產(chǎn)過程中設(shè)備封閉運(yùn)行，是一個(gè)選優(yōu)復(fù)壯的過程，屬純培養(yǎng)。 “ 液體制種 ” 實(shí)質(zhì)是利用生物發(fā)酵工程生產(chǎn)液體菌種，取代傳統(tǒng)、樸素的固體制 種；利用生物發(fā)酵原理，給菌絲生長提供一個(gè)最佳的營養(yǎng)、酸堿度、溫度、供氧量，使菌絲快速生長，迅速擴(kuò)繁，在短時(shí)間達(dá)到一定菌球數(shù)量，完成一個(gè)發(fā) 酵周期 ，即培 養(yǎng)完畢 [13]。 杏鮑菇的經(jīng)濟(jì)價(jià)值 杏鮑菇在國內(nèi)開發(fā)生產(chǎn)時(shí)間較 晚 ，但 發(fā)展速度很快 ，由于栽培技術(shù)難度較小、產(chǎn)量較高等原因，常規(guī)生產(chǎn)的杏鮑菇市場價(jià)格一直偏低，一般均在每千克 46 元，超市售價(jià)一般為每千克 810 元；夏季反季節(jié)栽培的產(chǎn)品，一般在每千克 10 元左右，最高曾達(dá) 18 元，而且貨源很少。 杏鮑菇的藥用價(jià)值 杏鮑菇中含有豐富的多糖物質(zhì)，多糖又稱多聚糖，是由 單糖縮合成的多聚物，廣泛存在于高等植物、動(dòng)物和微生物中 [5]。 杏 鮑菇 的 多糖 含量 為 ％ 。菌肉肥厚似鮑魚，因而得名杏鮑菇。在分類學(xué)上杏鮑菇隸屬于真菌界，擔(dān)子菌門，傘菌綱，無隔擔(dān)子菌亞綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬 [1]。 laccase activity gradually increased the previous six days, the sixth day maximum, the maximum is , then decreased rapidly, the seventh day after the laccase activity has been at a low level. In summary, Optimal Pleurotus eryngii liquid bacteria culture period is six days. KEY WORDS: eryngii。 medium pH has bee smaller。 結(jié)果顯 示： 菌球 直徑 先變 小后 增大 ，第 六天 達(dá)到 最小， 最小 為；菌 球密 度 先 變大 后變 小， 在第 六天 達(dá)到 最大 ， 最 大為 128個(gè) /ml；培養(yǎng)基 pH 一直變??；淀粉酶活性在 前三 天內(nèi)活性很低， 第四4 天迅速增大， 第六天達(dá)到最大，最大為 ， 隨后逐漸下降；羧甲基纖維素酶 在前四天內(nèi) 活性很低，到第五天迅速增大，第六天達(dá)到最大， 最大為 ， 之后又迅速下降；多酚氧化酶活性在前五天內(nèi)逐漸 上升，第七天達(dá)到最大， 最大為 ， 而后又下降；漆酶活性在前六天內(nèi)逐漸增加，第六天達(dá)到最大， 最大為 ， 而后迅速下降，第七天以后漆酶的活性一直處于較低水平。 進(jìn)度計(jì)劃 ～ 查找相關(guān)資料，進(jìn)行試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)、儀器藥品的準(zhǔn)備 ； ～ 進(jìn)行杏鮑菇液體培養(yǎng)， 獲得可靠、詳實(shí)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)