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【正文】 門 放入試管關(guān)門 自動進(jìn)行溶血 顯示 READY 燈亮 開門 取出試管再進(jìn)行下一個樣品測定。 （ *溶血前確認(rèn) A/B/C 管路充滿并能打出液體） 細(xì) 胞漿和核抗原 1．準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體，其中一管是同型對照。 2．首先每管中加入標(biāo)本 (骨髓或外周血 )100ul(根據(jù)細(xì)胞的多少決定 )，5ulCD45PC5 抗體。室溫避光 20 分鐘。 3．每管中加入固定液 100ul，劇烈振蕩混勻，室溫避光 15 分鐘。 4．各管中加入 PBS4ml。 5． 300g 離心 5 分鐘后，棄去上清液，振蕩混勻。 (1500r/min*5min) 6．各管中加入透膜劑 100ul，輕輕混勻，室溫避光 5 分鐘。 7．加抗體，陰性對照管中加入 10ul，其余各管加入相應(yīng)抗體各 10ul，室溫避光 15 分鐘。 8．各管中加入 4mlPBS，振蕩混勻。 9． 300g 離心 5 分鐘后，棄去上清液。 10．各管中加入 PBS500ul，振蕩混勻。 11．上機(jī)測樣 報告結(jié)果 報告百分?jǐn)?shù) 操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù) CV2％ 靈敏度 500— 1000 個熒光素分子 參考值 CD34+5% MPO+5% 粒系 20% 淋系 30% 臨床意義 用于血液病的診斷和分型診斷 方案（ Protocol） T 細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子 IFNγ /IL4 檢測 (流式細(xì)胞儀 ) 醫(yī)院檢驗科 操作規(guī)程文件號： 200 年 月 日起實施 第 1 版 (共 3 頁 ) 本規(guī)程每 2 年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部 門和／或個人 院檔案室保管者： 檢驗科 主任： 檢驗科 實驗室： T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子 IFNγ /IL4檢測 方法 流式細(xì)胞儀 (BeckmanCoulter， 貝克曼庫爾特 ) 原理 ： 直接免疫熒光法。肝素鈉抗凝全血在 PMA， Ionomycin 和 Monensin 存在下短期培養(yǎng) (輔助性 T 細(xì)胞通過細(xì)胞因子 IFNγ、 IL4 的產(chǎn)生分為 Thl、 Th2 兩個亞群。淋巴細(xì)胞活化以后 才分泌細(xì)胞因子，且迅速分泌到細(xì)胞外。因此，利用刺激劑 PMA+Ionomycin 體外激活淋巴細(xì)胞，然后用蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑 Monensin阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，使細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)滯留到一定的量 )，然后進(jìn)行細(xì)胞膜表面抗原和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，使用流式細(xì)胞儀對 CD4+細(xì)胞內(nèi)的IFNγ和 IL4 進(jìn)行測定。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。 采集部位 靜脈采血 抗凝劑 EDTA 或肝素抗凝血 要求 1．樣本量至 少 1ml。 2．樣本應(yīng)在采集后 6 小時內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3．樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在 109/L 之間。若 109/L， 樣本需要稀釋，用 PBS 稀釋；若 109/L，應(yīng)分離單個核 細(xì)胞。 4．溶血樣本不能用。 試劑 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系 (自配 ) 成分：刺激素 PMA、離子霉素、莫能霉素、小牛血清、 1640 液。 選白美國 SIGMA 公司 。 單克隆抗體 CD4— PC IL4PE、 IFNγ FITC 選自美國 BeckmanCoulter 公司。 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER 產(chǎn)品，未開瓶的試劑于 28℃保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于 28℃可穩(wěn)定 2 周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時進(jìn)行校準(zhǔn)。 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作 ： 細(xì)胞培養(yǎng)與染色 取 200ul 抗凝血加入 lOul CD4PC5 單抗，室溫避 光孵育 30 分鐘， RPMIl640洗滌一次，將細(xì)胞加入培養(yǎng)體系中， 5％ C02 37℃孵育 18 小時，取出后以 PBS洗一次。用專用細(xì)胞內(nèi)因子試劑進(jìn)行細(xì)胞固定、透膜。將細(xì)胞分成兩管，其一為測定管加入抗人 IL4PE 和 IFNγ FITC，另一管加入同型對照，室溫避光20 分鐘， PBS 洗滌一次，待測。 流式細(xì)胞儀測定 打開流式細(xì)胞儀及氬激光光源 (488nm)預(yù)熱 20min，同時儀器自動初始化；用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正光路和流路，然后依次檢測標(biāo)本，每份標(biāo)本檢測 50000 以上細(xì)胞，在前向散射光 (FS)和測向散射光 (SSC)散點圖中圈定淋巴細(xì)胞群，然后分析 CD4 陽性細(xì)胞中 IL4PE 和 IFNγ FITC 的表達(dá)。 ●淋巴細(xì)胞在 FS／ SSC 散點圖中位置，即 A 門內(nèi)細(xì)胞； ● A 門內(nèi) CD4 陽性細(xì)胞，即 B 門內(nèi)細(xì)胞； ● B 門內(nèi) TH 細(xì)胞亞群分布： 1 區(qū)數(shù)值 Th 1 細(xì)胞 (%) 4 區(qū)數(shù)值 Th 2 細(xì)胞 (%) 2 區(qū)數(shù)值 Th 0 細(xì)胞 (%) 報告結(jié)果 報告百分?jǐn)?shù) 操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù) CV2％ 靈敏度 500— 1000 個熒光素分子 正常參考值 Thl(IFNγ )： 177。 % Th2(IL4)： 177。 % ThO ： 177。 % 臨床意義 淋巴細(xì)胞均分泌多種細(xì)胞因子： Thl 細(xì)胞主要分泌 IL2， IL12， IFNγ 和 TNFb／ a 等， Th2 細(xì)胞主要分泌 IL4． IL5． IL6， IFNγ 為 Thl 最特異分泌的細(xì)胞因子， IL4 為 Th2 最特異分泌的細(xì)胞因子，所以可根據(jù)分泌的細(xì)胞因子來區(qū)分 Thl 與 Th2。 Thl 為 IFNγ +， Th2 為 IL4+。靜息狀態(tài) (人的正常生理狀態(tài)、即未受到任何刺激下 Th0 分化為 Thl 和 Th2 的能力非常弱，在外周血中僅含有極少量的 Thl 和 Th2 細(xì)胞，這時我們所能檢測的胞內(nèi)的 IFNγ 和 IL4 也微乎其微。當(dāng) Th細(xì)胞受到外界因素，如刺激素、病原體等刺激，其中 Th0 即會向 Thl 或 Th2 大量分化，此時我們檢測到的 IFNγ 和 IL4 也較多。本實驗的檢測實際上是檢測 Th 細(xì)胞對刺激素刺激的反應(yīng)能力。 方案（ Protocol） 細(xì)胞周期檢測 1. 細(xì)胞制備和染色 : 收獲細(xì)胞并 PBS 洗滌 ,10*46 個 ,染色過程之前要經(jīng)過100300 目濾網(wǎng)過濾 ,離心棄上清待用 。 使用 BECKMAN COULTER DNAPREP 試劑盒 (LPR:打孔 \固定 \溶血 。 DNA STAIN: PI,RNAase):上述細(xì)胞內(nèi)加入 LPR 100 ul,室溫避光 20 MIN,再加入 DNA STAIN 1000 ul,室溫避光20 MIN,上機(jī)檢測 . 使用酒精固定和 PI: 上述細(xì)胞內(nèi)加入 70%預(yù)冷酒精 ,4 C過夜 。 離心棄上清后加入 PI工作液室溫避光 30MIN. 2. 從 PROTOCOL 中找出 DNA CONTENTS