【正文】 自動進(jìn)行溶血 顯示 READY 燈亮 開門 取出試管再進(jìn)行下一個樣品測定。若 109/L， 樣本需要稀釋，用 PBS 稀釋；若 109/L，應(yīng)分離單個 核 細(xì)胞。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。 流式細(xì)胞儀操作規(guī)程目錄 1：淋巴細(xì)胞亞群測定 2： HLAB27 測定 3： CD55／ CD59 測定 4：血小板抗體測定 5：紅細(xì)胞抗體測定 6：粒細(xì)胞抗體測定 7：白血病免疫分型測定 8：淋巴細(xì)胞 T 細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子 IFNγ /IL4 測定 9： XL 操作步驟 淋巴細(xì)胞亞群測定 (流式細(xì)胞儀 ) 醫(yī)院檢驗(yàn)科 操作規(guī)程文件號： 200 年 月 日起實(shí)施 第 1 版 (共 3 頁 ) 本規(guī)程每 2 年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和／或個人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： 淋巴細(xì)胞亞群測定 (CD系列 ) 方法 流式細(xì)胞儀 (BeckmanCoulter， 貝克曼 庫爾特 ) 原理 ： 雙 /三色直接免疫熒光法。根據(jù)淋巴細(xì)胞膜上 CD 分子表達(dá)的不同，流式細(xì)胞儀可以分辨出淋巴細(xì)胞及其各種不同的亞群，利用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算出淋巴細(xì)胞 亞群的百分?jǐn)?shù)。 3．樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在 109/L 之間。 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備 ： 1)按照要求，分別向已編好號的試管中加入 20 ul 單克隆抗體和同型對照 2)分別向試管中加入混勻的 100u1 抗凝血。 Th／ Ts比值升高 ：表示免疫功能亢進(jìn)：見于自身免疫性疾病，如 SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無力以及 HBsAg+乙肝等。NK 細(xì)胞也參與第二型超敏反應(yīng)和移植物抗宿反應(yīng)，白介素 2 治療后；外周血 NK細(xì)胞增加。 采集部位 靜脈采血 抗凝劑 EDTA 或肝素抗凝血 要求 1．樣本量至少 1ml。 4．溶血樣本不能用。 （ *溶血前確認(rèn) A/B/C 管路充滿并能打出液體） 5)洗、離心、上機(jī)測樣（ 備注： 測 B27一定要至少洗一遍方可上機(jī)檢測 ） 報(bào)告結(jié)果 報(bào)告陰陽性 操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù) CV2％ 靈敏度 500— 1000 個熒光素分子 參考值 陽性 ： HLAB27 陽性而 HLAB7 陰性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度在 以上。血細(xì)胞(紅細(xì)胞和白細(xì)胞 )通過膜上的抗原分子與熒光素標(biāo)記的 CD55或 CD59的多克隆抗體結(jié)合。 2．樣本應(yīng)在采集后 6 小時內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。分別向二管中加入樣品 100ul。 4．洗滌離心 5．上機(jī)測樣 (二 )紅細(xì)胞 CD55／ CD59 檢測 1．準(zhǔn)備 2 支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記 2． 分別加入 CD55／ CD59 10ul 和相應(yīng)的同型對照 10ul。 報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù) 操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù) CV2％ 靈敏度 500— 1000 個熒光素分子 參考值 CD5597% CD5997% PNH 的臨界值： RBC CD5995% WBC CD5990% PNH 的診斷值： RBC CD5991% 大部分 80% 中性粒細(xì)胞 CD5984% 臨床意義 用于 AA 和 PNH 的診斷和分型診斷。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。若 450 109/L， 樣本需要稀釋，用 PBS 稀釋；若 150 109/L，應(yīng)多采集進(jìn)行富集達(dá)到流式檢測的細(xì)胞數(shù)。 3)分別向已編好號的試管中加入 10 ul 單克隆抗體和同型對照 (IgGFITC) 4)分別向試管中加入準(zhǔn)備好的 10u1 含血小板的 PBS（血小板的量約為 106）（血小板若在正常范圍，稀釋到原量直接取 10u1。 FITC 標(biāo)記的 各型多克隆抗體，加到全血中，與紅細(xì)胞膜上的相應(yīng)的 IgGFc 片段結(jié)合，經(jīng)過洗滌 (和固定 )等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。 3．溶血樣本不能用。 FITC 標(biāo)記的各型多克隆抗體，加到經(jīng)溶血處理后的樣本中，與粒系胞膜上的相應(yīng)的 IgGFc 片段結(jié)合，經(jīng)過洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。若 109/L，樣本需要稀釋，用 PBS 稀釋；若 109/L，應(yīng)分離單個核細(xì)胞。 （ *溶血前確認(rèn) A/B/C 管路充滿并能打出液體） 2)分別向已編好號的試管中加入 10 ul 單克隆抗體和同型對照 (IgGFITC) 2)分別向試管中加入經(jīng)溶血處理得樣本 100u1。三色染色在白血病免疫分型中較為常用。 3．樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在 109/L 之間。 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作 樣本制備 ： 細(xì)胞膜表面抗原 1．首先準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體。 （ *溶血前確認(rèn) A/B/C 管路充滿并能打出液體） 細(xì) 胞漿和核抗原 1．準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體，其中一管是同型對照。 4．各管中加入 PBS4ml。 8．各管中加入 4mlPBS，振蕩混勻。肝素鈉抗凝全血在 PMA， Ionomycin 和 Monensin 存在下短期培養(yǎng) (輔助性 T 細(xì)胞通過細(xì)胞因子 IFNγ、 IL4 的產(chǎn)生分為 Thl、 Th2 兩個亞群。 采集部位 靜脈采血 抗凝劑 EDTA 或肝素抗凝血 要求 1．樣本量至 少 1ml。 4．溶血樣本不能用。 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER 產(chǎn)品，未開瓶的試劑于 28℃保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于 28℃可穩(wěn)定 2 周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時進(jìn)行校準(zhǔn)。 流式細(xì)胞儀測定 打開流式細(xì)胞儀及氬激光光源 (488nm)預(yù)熱 20min，同時儀器自動初始化；用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正光路和流路，然后依次檢測標(biāo)本，每份標(biāo)本檢測 50000 以上細(xì)胞，在前向散射光 (FS)和測向散射光 (SSC)散點(diǎn)圖中圈定淋巴細(xì)胞群，然后分析 CD4 陽性細(xì)胞中 IL4PE 和 IFNγ FITC 的表達(dá)。 % 臨床意義 淋巴細(xì)胞均分泌多種細(xì)胞因子： Thl 細(xì)胞主要分泌 IL2， IL12， IFNγ 和 TNFb／ a 等， Th2 細(xì)胞主要分泌 IL4． IL5． IL6， IFNγ 為 Thl 最特異分泌的細(xì)胞因子， IL4 為 Th2 最特異分泌的細(xì)胞因子，所以可根據(jù)分泌的細(xì)胞因子來區(qū)分 Thl 與 Th2。本實(shí)驗(yàn)的檢測實(shí)際上是檢測 Th 細(xì)胞對刺激素刺激的反應(yīng)能力。 離心棄上清后加入 PI工作液室溫避光 30MIN. 2. 從 PROTOCOL 中找出 DNA CONTENTS