蛋白提取方法-資料下載頁
2024-11-19 03:42本頁面
【正文】 質(zhì)變性，同時(shí)要注意散熱。勻漿是機(jī)體軟組織破碎最常用的方法之一。由于勻漿過程中蛋白質(zhì)被蛋白酶降解的可能性較小，所以勻漿是簡(jiǎn)便、迅速和風(fēng)險(xiǎn)小的組織破碎方法，我們實(shí)驗(yàn)室在破碎腦和脊髓組織時(shí)常用此法；由于神經(jīng)組織比較柔軟，液氮研磨法也很適合，本實(shí)驗(yàn)中我們使用了這一方法破碎大鼠脊髓組織，中樞神經(jīng)組織由于富含脂類，沉淀法和高速離心法可以使蛋白和脂類干擾物質(zhì)有效分離，但沉淀法的缺點(diǎn)是再溶解時(shí)蛋白損失嚴(yán)重。高速離心的缺點(diǎn)是需要樣品量大，如BeckmanL765超速離心機(jī)的離心管容量為8ml，不適用小量樣品的制備。 在眾多的裂解液配方中，我們主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,%兩性電解質(zhì)加蛋白酶抑制劑混合物，原因是這一配方經(jīng)長(zhǎng)期使用很穩(wěn)定，裂解效率也較高，非常適合小量細(xì)胞蛋白提取要求。針對(duì)富脂的中樞神經(jīng)組織中脂類物質(zhì)與蛋白相互作用，高濃度的尿素可以造成強(qiáng)變性條件(但如果再提高尿素濃度，尿素就容易析出，影響蛋白的溶解)，過量的去污劑也可以減少脂類的污染，兩性電解質(zhì)可以提高蛋白的溶解度，同時(shí)有利于等待聚焦。早期我們加入Tris堿以防止蛋白的水解，但是由于鹽離子的引入，導(dǎo)致IEF電壓過低，影響聚焦。內(nèi)容總結(jié)
（1）(4)棄上清，PBS洗三次（室溫,500g，5min）， (5)在離心管中加入1mlPBS，重懸細(xì)胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中
（2）(9)執(zhí)行Biofuge存儲(chǔ)程序6，15℃，40000g，離心1hr(Biofuge)
（3）吸干殘留的PBS，估計(jì)樣品體積，加入5倍體積裂解液，混勻，冰浴中以最大功率超聲破碎細(xì)胞（310s）
語文相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1