【正文】 發(fā)育之間的相互關(guān)系。4，完成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）組蛋白修飾模式的檢測和比較；5，完成生物信息學(xué)分析結(jié)果確定的相關(guān)基因?qū)?xì)胞減數(shù)分裂的影響研究，初步完成相關(guān)載體、DNA文庫的構(gòu)建，篩選與視黃素受體相互作用的蛋白，確定12個參與減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的新基因；6，體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）產(chǎn)生具有精子分化表型的精原細(xì)胞，并通過小鼠曲細(xì)精管注射實驗，檢測體外誘導(dǎo)分化所得精原細(xì)胞形成克隆的能力，通過體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測其衍生細(xì)胞的受精和支持胚胎發(fā)育的能力。7，構(gòu)建35個第一和第二課題篩選得到的重要基因敲除載體（第二批）；8，初步完成小鼠模型的表型分析，找到這些基因可能調(diào)控的信號途徑；9，闡明新發(fā)現(xiàn)的生長因子和激素等細(xì)胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控PGC分化的分子機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)體系；10，探明不同來源的牛ES細(xì)胞分子生物學(xué)方面的差異，為其體外誘導(dǎo)分化做準(zhǔn)備。11，初步建立牛ES細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的技術(shù)體系。利用卵母細(xì)胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法驗證誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞的能力。12，撰寫論文810篇，申請專利12項。第四年：1， 利用四環(huán)素調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng), RNAi, ChIP等技術(shù)闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向PGC誘導(dǎo)過程中的作用與機(jī)理。2， 通過cDNA基因芯片篩選的方法系統(tǒng)分析胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞的基因表達(dá)譜。從兩種細(xì)胞中分離出的RNA與小鼠的表達(dá)DNA陣列雜交，以檢測基因表達(dá)的上調(diào)或下降。3， 對視黃酸在生殖細(xì)胞中的受體及輔助受體復(fù)合物的形成及其中各成分的生物學(xué)功能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制加以研究。4， 通過卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞是否可替代內(nèi)源精子細(xì)胞支持胚胎發(fā)育，產(chǎn)生后代。5， 建立特定基因過量表達(dá)或缺失的小鼠純合體模型, 并研究上述特定基因過量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞及小鼠純合體的表型及對PGC及功能性配子形成的影響，探討關(guān)鍵基因（如激素受體）在小鼠PGC特化及減數(shù)分裂形成功能性配子過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。6， 利用上述人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)建PGC特化的報告基因體系及PGC生成的培養(yǎng)體系，優(yōu)化從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化PGC的條件，探討關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)理。7， 利用卵母細(xì)胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法對誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞所形成的囊胚進(jìn)行分子生物學(xué)、生理學(xué)分析及安全性檢測。并為其體內(nèi)發(fā)育做準(zhǔn)備。8， 召開國際生殖學(xué)研討會。預(yù)期目標(biāo)：1， 明確端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向PGC誘導(dǎo)過程中的作用機(jī)理。2， 完成胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞的基因表達(dá)譜的檢測和比較。3， 探索視黃酸在生殖細(xì)胞中的受體及輔助受體復(fù)合物的形成及其中各成分的生物學(xué)功能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。4， 體外誘導(dǎo)分化獲得生殖細(xì)胞，并通過卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代。5， 完成第一批小鼠模型的表型分析和機(jī)理研究。6， 初步完成重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機(jī)理研究。7， 得到優(yōu)化的人ESC分化PGC的培養(yǎng)體系，初步闡明細(xì)胞外因子的作用機(jī)理；8， 獲得以牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)而來的生殖細(xì)胞體外所形成的囊胚，利用分子生物學(xué)手段驗證這些胚胎的生物活性，如甲基化、乙?；约岸肆Ｃ搁L短和活性等，并與正常體內(nèi)胚胎進(jìn)行比較，初步闡明這種牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎是否具有優(yōu)勢、是否具備安全性。9， 召開一次生殖學(xué)研討會。10， 撰寫論文810篇，申請專利13項。第五年：1， 利用以上的研究手法，與課題4共同篩選在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞分化過程中的Nanog, Oct4，RAR/RXR的結(jié)合蛋白，檢索調(diào)控Blimp1 、Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa等基因表達(dá)的調(diào)控因子。明確組蛋白修飾及端粒蛋白和端粒酶的作用。2， 通過蛋白組學(xué)，分離，純化胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞的細(xì)胞膜成分，利用蛋白雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析，深入研究細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的差別，綜合前四年研究結(jié)果分析胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞在DNA甲基化模式、基因表達(dá)和細(xì)胞表面蛋白成分的差異，闡明造成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的不同發(fā)育潛力的主要原因。3， 綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的機(jī)制。4， 進(jìn)一步研究體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞通過胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得的后代的表型及生理功能，評估體外誘導(dǎo)分化獲得的生殖細(xì)胞對其后代的影響。5， 研究特定基因過量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞及小鼠純合體表型,并探討相關(guān)的體外分子機(jī)制實驗。6， 結(jié)合其他課題組的研究成果,利用已完善的PGC及功能性配子誘導(dǎo)體系,檢測新發(fā)現(xiàn)的重要基因(如Oct4,Nanog的相互作用分子等)的功能及分子作用機(jī)理。7， 牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎體內(nèi)發(fā)育能力，并與體內(nèi)來源胚胎在體內(nèi)正常發(fā)育進(jìn)行比較研究。8， 總結(jié)研究結(jié)果，匯總數(shù)據(jù)，提交研究報告，撰寫論文。預(yù)期目標(biāo)：1，在整體細(xì)胞水平上初步確立干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。2，完成胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的檢測和比較；綜合前四年研究結(jié)果，闡明造成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的不同發(fā)育潛力的主要原因；綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的機(jī)制；完成對卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代的表型分析。3，完成第二批小鼠動物模型表型分析和機(jī)理研究；4，重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機(jī)理研究；5，將牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎移植于同期誘導(dǎo)發(fā)情的母體內(nèi)，力爭獲得后代。6， 比較分析兩種胚胎生成后代牛的異同，初步闡明以牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎是否具備可行性和優(yōu)越性。以期真正意義上建立牛ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化功能性生殖細(xì)胞的技術(shù)平臺，為經(jīng)濟(jì)動物的改良服務(wù)。7， 整理論文810篇，申請專利35項。內(nèi)容總結(jié)
（1）一、研究內(nèi)容
本項目將以胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）為技術(shù)平臺，研究哺乳動物干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化以及生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和機(jī)理，并建立研究生殖細(xì)胞分化所需的生物技術(shù)平臺及多種細(xì)胞及小鼠模型，從而提高干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率，為大型經(jīng)濟(jì)動物優(yōu)質(zhì)培育奠定基礎(chǔ)