【正文】 3，完成第二批小鼠動物模型表型分析和機理研究；4，重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機理研究；5，將牛ES細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎移植于同期誘導發(fā)情的母體內(nèi)，力爭獲得后代。3， 綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細胞減數(shù)分裂的機制。5， 完成第一批小鼠模型的表型分析和機理研究。6， 利用上述人胚胎干細胞中創(chuàng)建PGC特化的報告基因體系及PGC生成的培養(yǎng)體系，優(yōu)化從人胚胎干細胞誘導分化PGC的條件，探討關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機理。利用卵母細胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法驗證誘導分化的生殖細胞的能力。11， 已建立的不同胚胎來源（體內(nèi)胚胎、體外受精胚胎和克隆胚胎）的牛ES細胞進行基因表達分析。3， 全面篩選與組蛋白修飾相關(guān)的基因，通過基因敲除或過量表達，驗證不同修飾與PGC或精子發(fā)育之間的相互關(guān)系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾（著重于組蛋白?；⒓谆难芯浚┰赑GC形成中的功能與調(diào)控機制。11， 建立特定基因過表達和knockdown的ES細胞株，得到嵌合體小鼠（第一批）。3， 完成精原干細胞和胚胎干細胞、誘導多能干細胞的DNA甲基化測序。9， 在優(yōu)化的體外培養(yǎng)條件下誘導ESC向PGC分化，運用基因芯片和定量PCR等技術(shù)篩選PGC特異的基因（主要是GPCR和其他受體介導的信號傳導分子）并研究其表達模式。4， 利用測序的方法（如CpG二核苷酸位點上的甲基化）分析精原干細胞和胚胎干細胞的基因組DNA，印跡基因和一些關(guān)鍵的多能性基因的DNA甲基化模式。6， 構(gòu)建小鼠配子中特異表達的Gpr126等35個重要基因的條件敲除載體或轉(zhuǎn)基因載體。6，建立特定基因過量表達或缺失的轉(zhuǎn)基因及基因敲除載體。4， 以其它子課題的蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等相關(guān)研究為基礎(chǔ)，利用創(chuàng)建的牛ES細胞體系，探討牛干細胞自我更新和分化的途徑。課題承擔單位：中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院課題負責人： 楊東山 副研究員（中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）主要學術(shù)骨干：戚華宇 研究員 （中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院） 謝 亭 教授 （中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院） 徐仁和 教授 （中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）課題經(jīng)費比例：占申請經(jīng)費的23%。從表觀遺傳學著手，研究PGC誘導過程中組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與PGC或精子發(fā)育之間的相互關(guān)系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾（著重于組蛋白?；?、甲基化的研究）在PGC形成中的功能與調(diào)控機制。首席科學家將充分發(fā)揮課題負責人和學術(shù)帶頭人的作用，采用學科交叉、分工合作的方式來實施研究計劃。項目設(shè)負責人1 名（首席科學家），負責整個項目的貫通實施。(2)本項目在充分利用課題組已建立的蛋白質(zhì)組學研究平臺，BiFC研究平臺（松陽洲教授研究團隊獨創(chuàng)），信息學研究平臺和基因組學研究平臺的基礎(chǔ)上，發(fā)展和創(chuàng)建綜合技術(shù)平臺及多種細胞和動物模型，分析從干細胞誘導生成生殖細胞過程中的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和基因調(diào)控機理，填補生殖細胞發(fā)育機理和干細胞分化機制研究領(lǐng)域的空白，為干細胞的再生醫(yī)學及畜牧產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用提供新的途徑。這些都是確保研究項目順利實施和取得重大成果的最基本、最關(guān)鍵的因素。我們在干細胞學、胚胎發(fā)育學、生殖學等領(lǐng)域進行了多年的研究，取得了一些重要的成果，具備完成本項目的堅實基礎(chǔ)。 干細胞的功能則是通過細胞內(nèi)外因子對蛋白質(zhì)組和基因組的動態(tài)調(diào)控來實現(xiàn)的。7，建立13個體外培養(yǎng)生長狀況良好、表達干細胞標記的牛ES細胞系，初步闡明牛干細胞自我更新和分化的可能途徑。系統(tǒng)地分析精原干細胞與胚胎干細胞之間特異性差異，闡明雄性生殖細胞中誘導減數(shù)分裂的分子機制。探討以上關(guān)鍵信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵因子在誘導牛干細胞向生殖細胞分化過程中的調(diào)控機理。 (2) 利用基因組學、蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)，系統(tǒng)地分析精原干細胞和胚胎干細胞的特異性差異。同時，建立體外誘導培養(yǎng)功能性生殖細胞的技術(shù)體系，以小鼠為主要研究對象，嘗試應(yīng)用干細胞誘導產(chǎn)生的生殖細胞來培育優(yōu)化動物，最終確立我國在這一極富競爭性的前沿探索領(lǐng)域的領(lǐng)先地位。8，力爭建立牛ES細胞體外誘導分化形成功能性配子（精子、卵子）的技術(shù)體系。 因此探討干細胞生長微環(huán)境、蛋白質(zhì)間相互作用、組蛋白修飾與基因表達之間的相互關(guān)系，并依此建立干細胞向生殖細胞分化的調(diào)控蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和定向誘導技術(shù)體系將是本項目的重要研究方向。研究方案建立在申請者以及項目組成員大量的相關(guān)研究工作的基礎(chǔ)上，實驗設(shè)計合理周密。本項目課題組成員熟悉當前的研究狀況和方法，對本項目的研究具有較強的掌控能力和應(yīng)變能力，能夠保證項目的順利完成。(3)本項目著眼于技術(shù)創(chuàng)新, 通過建立誘導干細胞生成生殖細胞的技術(shù)體系，獲得功能性生殖細胞，為大型經(jīng)濟動物優(yōu)良種群的培育提供技術(shù)支持。首席科學家聘任若干學術(shù)專家組成項目顧問專家組，參與項目的領(lǐng)導、組織、運行和管理，協(xié)助項目負責人，調(diào)整和確定項目的方向及技術(shù)路線，制定有效可行的研究計劃，指導協(xié)調(diào)各課題的工作，督促各課題間的交流，并審核各子課題的進展情況。同時，首席科學家將在相關(guān)部門的領(lǐng)導下，根據(jù)國家規(guī)定，通過項目專家委員會，采用激勵和滾動機制對項目進行管理。3, 利用四環(huán)素調(diào)節(jié)表達系統(tǒng), RNAi, ChIP等技術(shù)闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向PGC誘導過程中的作用與機理。課題3， 誘導胚胎干細胞向原始生殖細胞分化的體系及機理研究研究目標：本課題將完善胚胎干細胞分化為PGC的技術(shù)體系，建立PGC特化過程中關(guān)鍵因子的轉(zhuǎn)基因及基因敲除的胚胎干細胞株及小鼠模型，揭示關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號網(wǎng)絡(luò)在PGC形成過程中的功能及調(diào)控機理。5， 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)、選擇合適的生長因子、轉(zhuǎn)錄因子和培養(yǎng)體系誘導牛ES細胞分化為雄性生殖細胞，為經(jīng)濟動物的改良服務(wù)。7，在人胚胎干細胞中創(chuàng)建穩(wěn)定表達標志PGC特化的報告基因體系。7， 構(gòu)建Blimp1GFP和StellaGFP等PGC特化報告基因穩(wěn)定表達的人胚胎干細胞。5， 對經(jīng)過視黃酸刺激的精原干細胞進行基因芯片分析來研究其表達譜。10， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞株或小鼠雜合體模型。4， 完成對精原干細胞的基因芯片分析，確定23個受視黃酸刺激表達明顯上調(diào)的基因。12