【正文】 模型技術(shù)平臺(tái)。2，建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出控制PGC基因表達(dá)的幾個(gè)關(guān)鍵因子。（1）利用蛋白質(zhì)組學(xué)，BiFC組學(xué), 信息學(xué)研究平臺(tái)，建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選控制PGC基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，并闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向PGC誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用機(jī)理。5，闡明雄性生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂的分子機(jī)制。 3，可行性分析本項(xiàng)目的總體方案是切實(shí)可行的。本項(xiàng)目的選題涉及干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過(guò)程中重要蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；雄性生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)理；胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化的體系及機(jī)理；干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育上的應(yīng)用等科學(xué)問(wèn)題。6，課題間的相互關(guān)系本項(xiàng)目以中山大學(xué)為主體，聯(lián)合中國(guó)科學(xué)學(xué)院，華東師范大學(xué)及中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位，圍繞總體研究目標(biāo)，本項(xiàng)目設(shè)立4個(gè)課題組，研究過(guò)程中相互配合、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提倡資源共享。分析核受體RAR/RXR復(fù)合體在精原細(xì)胞中的特異性及其調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的機(jī)理。4，分離、純化精原干細(xì)胞，利用RAR/RXR在DNA上結(jié)合區(qū)域的序列保守性，通過(guò)生物信息學(xué)，分析、檢索含有與stra8等同源的調(diào)控區(qū)的新基因，尋找已知減數(shù)分裂基因組中在精子前體細(xì)胞中表達(dá)，受視黃酸誘導(dǎo)調(diào)控的基因，為研究減數(shù)分裂調(diào)控機(jī)制檢索目標(biāo)基因。2， 通過(guò)過(guò)量表達(dá)或RNAi的研究手法，從PGC或生殖母細(xì)胞調(diào)控元及與其相互作用的蛋白質(zhì)組中篩選出控制Blimp1, Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa和DAZL基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。預(yù)期目標(biāo)：1， 篩選出控制PGC基因表達(dá)的68個(gè)關(guān)鍵因子。第三年：1， 利用高通量的染色體免疫沉淀結(jié)合全基因組DNA芯片或短序列測(cè)序技術(shù)（“ChIPchip”和“ChIPseq”），研究PGC誘導(dǎo)過(guò)程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過(guò)程。7，構(gòu)建35個(gè)第一和第二課題篩選得到的重要基因敲除載體（第二批）；8，初步完成小鼠模型的表型分析，找到這些基因可能調(diào)控的信號(hào)途徑；9，闡明新發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子和激素等細(xì)胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控PGC分化的分子機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)體系；10，探明不同來(lái)源的牛ES細(xì)胞分子生物學(xué)方面的差異，為其體外誘導(dǎo)分化做準(zhǔn)備。3， 探索視黃酸在生殖細(xì)胞中的受體及輔助受體復(fù)合物的形成及其中各成分的生物學(xué)功能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。預(yù)期目標(biāo)：1，在整體細(xì)胞水平上初步確立干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。5， 研究特定基因過(guò)量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞及小鼠純合體表型,并探討相關(guān)的體外分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)。并為其體內(nèi)發(fā)育做準(zhǔn)備。預(yù)期目標(biāo)：1，把握PGC誘導(dǎo)過(guò)程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過(guò)程。13， 完善從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)PGC生成的培養(yǎng)體系。11， 利用上述人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)建PGC特化的報(bào)告基因體系, 建立完善從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)PGC生成的培養(yǎng)體系。8， 獲得促使牛ICM細(xì)胞體外維持多能性的最佳細(xì)胞因子組合，建立8個(gè)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況良好、表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記的牛類(lèi)胚胎干細(xì)胞系。6， 以牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的精子為核供體，分析胞質(zhì)內(nèi)注射后胚胎的發(fā)育能力，建立以ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為功能性生殖細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)。4, 探討在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過(guò)程中，以上信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的適用性。顧問(wèn)專(zhuān)家由相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域成就卓著的專(zhuān)家組成，承擔(dān)單位之外的專(zhuān)家占絕大多數(shù)。4，創(chuàng)新點(diǎn)本項(xiàng)目探討影響國(guó)計(jì)民生的的重大科學(xué)問(wèn)題。2，技術(shù)途徑根據(jù)以上的學(xué)術(shù)思路，本項(xiàng)目的總體研究技術(shù)途徑如圖2所示。五年預(yù)期目標(biāo)1，發(fā)展基于干細(xì)胞學(xué)和生殖細(xì)胞學(xué)研究的一整套方法和綜合技術(shù)平臺(tái)。同時(shí)利用表觀遺傳學(xué)研究技術(shù)，分析PGC誘導(dǎo)過(guò)程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過(guò)程和不同修飾與PGC發(fā)育之間的相互關(guān)系。6，建立一整套誘導(dǎo)PGC生成的培養(yǎng)體系。首先，本項(xiàng)目提出的主要科學(xué)問(wèn)題和研究目標(biāo)不僅具有理論和實(shí)際依據(jù)，而且都是該領(lǐng)域前沿性和關(guān)鍵性的問(wèn)題。將基礎(chǔ)科學(xué)與實(shí)際應(yīng)用相結(jié)合，力爭(zhēng)在解答基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題的同時(shí)，發(fā)展新的動(dòng)物繁殖技能。本項(xiàng)目的執(zhí)行采用首席科學(xué)家負(fù)責(zé)制。3．利用全細(xì)胞成像及分子生物學(xué)技術(shù)分析誘導(dǎo)分化的雄性生殖細(xì)胞，通過(guò)小鼠曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞注射和卵細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射，探索體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞的生物學(xué)功能及其對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響。5，開(kāi)展小鼠曲細(xì)精管注射及卵母細(xì)胞胞漿注射實(shí)驗(yàn)，建立精原干細(xì)胞和精子細(xì)胞的功能檢測(cè)體系，以便于對(duì)體外誘導(dǎo)分化所得精原（精子）細(xì)胞的生物學(xué)功能加以驗(yàn)證。3， 利用生物信息學(xué)研究手法，建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2， 建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2， 利用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)推測(cè)組蛋白各種不同修飾和基因表達(dá)之間的因果關(guān)系及組合關(guān)系，并推測(cè)組蛋白修飾相互之間形成的邏輯關(guān)系。11，初步建立牛ES細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的技術(shù)體系。4， 體外誘導(dǎo)分化獲得生殖細(xì)胞，并通過(guò)卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代。2，完成胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的檢測(cè)和比較；綜合前四年研究結(jié)果，闡明造成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的不同發(fā)育潛力的主要原因；綜合分析闡明通過(guò)視黃酸調(diào)控雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的機(jī)制；完成對(duì)卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代的表型分析。4， 進(jìn)一步研究體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞通過(guò)胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得的后代的表型及生理功能，評(píng)估體外誘導(dǎo)分化獲得的生殖細(xì)胞對(duì)其后代的影響。7， 利用卵母細(xì)胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法對(duì)誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞所形成的囊胚進(jìn)行分子生物學(xué)、生理學(xué)分析及安全性檢測(cè)。12， 探索牛ES細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的能力。12， 獲得3個(gè)以上特定基因敲除的小鼠干細(xì)胞品系。10， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立特定基因過(guò)量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞株或小鼠雜合體模型。7， 構(gòu)建Blimp1GFP和StellaGFP等PGC特化報(bào)告基因穩(wěn)定表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞。5， 通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、選擇合適的生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子和培養(yǎng)體系誘導(dǎo)牛ES細(xì)胞分化為雄性生殖細(xì)胞，為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的改良服務(wù)。3, 利用四環(huán)素調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng), RNAi, ChIP等技術(shù)闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向PGC誘導(dǎo)過(guò)程中的作用與機(jī)理。首席科學(xué)家聘任