【正文】 以期真正意義上建立牛ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化功能性生殖細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)，為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的改良服務(wù)。預(yù)期目標(biāo)：1，在整體細(xì)胞水平上初步確立干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。5， 研究特定基因過(guò)量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞及小鼠純合體表型,并探討相關(guān)的體外分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)。明確組蛋白修飾及端粒蛋白和端粒酶的作用。7， 得到優(yōu)化的人ESC分化PGC的培養(yǎng)體系，初步闡明細(xì)胞外因子的作用機(jī)理；8， 獲得以牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)的生殖細(xì)胞體外所形成的囊胚，利用分子生物學(xué)手段驗(yàn)證這些胚胎的生物活性，如甲基化、乙?；约岸肆Ｃ搁L(zhǎng)短和活性等，并與正常體內(nèi)胚胎進(jìn)行比較，初步闡明這種牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的生殖細(xì)胞所形成的胚胎是否具有優(yōu)勢(shì)、是否具備安全性。3， 探索視黃酸在生殖細(xì)胞中的受體及輔助受體復(fù)合物的形成及其中各成分的生物學(xué)功能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。并為其體內(nèi)發(fā)育做準(zhǔn)備。4， 通過(guò)卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測(cè)體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞是否可替代內(nèi)源精子細(xì)胞支持胚胎發(fā)育，產(chǎn)生后代。第四年：1， 利用四環(huán)素調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng), RNAi, ChIP等技術(shù)闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向PGC誘導(dǎo)過(guò)程中的作用與機(jī)理。7，構(gòu)建35個(gè)第一和第二課題篩選得到的重要基因敲除載體（第二批）；8，初步完成小鼠模型的表型分析，找到這些基因可能調(diào)控的信號(hào)途徑；9，闡明新發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子和激素等細(xì)胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控PGC分化的分子機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)體系；10，探明不同來(lái)源的牛ES細(xì)胞分子生物學(xué)方面的差異，為其體外誘導(dǎo)分化做準(zhǔn)備。預(yù)期目標(biāo)：1，把握PGC誘導(dǎo)過(guò)程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過(guò)程。通過(guò)體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測(cè)其衍生細(xì)胞的生物學(xué)功能。5， 根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，挑選幾個(gè)相關(guān)基因開展分子、細(xì)胞等方面的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)檢測(cè)它們對(duì)精原細(xì)胞減數(shù)分裂的影響。第三年：1， 利用高通量的染色體免疫沉淀結(jié)合全基因組DNA芯片或短序列測(cè)序技術(shù)（“ChIPchip”和“ChIPseq”），研究PGC誘導(dǎo)過(guò)程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過(guò)程。13， 完善從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)PGC生成的培養(yǎng)體系。9， 建立適合PGC生長(zhǎng)及減數(shù)分裂的gonadal細(xì)胞共培養(yǎng)體系。5， 對(duì)視黃酸受體、輔助受體復(fù)合物進(jìn)行生化分析，確定其基本成分；設(shè)計(jì)、構(gòu)建用于篩選相關(guān)蛋白相互作用的載體、DNA文庫(kù)。預(yù)期目標(biāo)：1， 篩選出控制PGC基因表達(dá)的68個(gè)關(guān)鍵因子。11， 利用上述人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)建PGC特化的報(bào)告基因體系, 建立完善從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)PGC生成的培養(yǎng)體系。7， 通過(guò)報(bào)告基因和表面抗原標(biāo)記，篩選在體外培養(yǎng)體系中參與PGC特化的生長(zhǎng)因子和激素等細(xì)胞外因子或小分子化合物。利用特定的抗體進(jìn)行免疫沉淀或染色質(zhì)免疫沉淀對(duì)視黃酸在生殖細(xì)胞中的受體、輔助受體復(fù)合物進(jìn)行生化分析。2， 通過(guò)過(guò)量表達(dá)或RNAi的研究手法，從PGC或生殖母細(xì)胞調(diào)控元及與其相互作用的蛋白質(zhì)組中篩選出控制Blimp1, Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa和DAZL基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。8， 獲得促使牛ICM細(xì)胞體外維持多能性的最佳細(xì)胞因子組合，建立8個(gè)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況良好、表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記的牛類胚胎干細(xì)胞系。4， 建立小鼠曲細(xì)精管注射及卵母細(xì)胞胞漿注射技術(shù)體系。8，優(yōu)化牛ICM細(xì)胞體外維持多能性的細(xì)胞因子組合，嘗試獲取牛類胚胎干細(xì)胞系和體外培養(yǎng)的技術(shù)平臺(tái)。4，分離、純化精原干細(xì)胞，利用RAR/RXR在DNA上結(jié)合區(qū)域的序列保守性，通過(guò)生物信息學(xué)，分析、檢索含有與stra8等同源的調(diào)控區(qū)的新基因，尋找已知減數(shù)分裂基因組中在精子前體細(xì)胞中表達(dá)，受視黃酸誘導(dǎo)調(diào)控的基因，為研究減數(shù)分裂調(diào)控機(jī)制檢索目標(biāo)基因。6， 以牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的精子為核供體，分析胞質(zhì)內(nèi)注射后胚胎的發(fā)育能力，建立以ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為功能性生殖細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)。課題4，干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育上的應(yīng)用研究目標(biāo)：建立牛ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系和體外定向誘導(dǎo)分化技術(shù)平臺(tái)，從而揭示牛多能干細(xì)胞體外分化與發(fā)育的潛能,獲得具有生物活性的配子（精子、卵子），利用這些技術(shù)加速優(yōu)良經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種群的培育。研究?jī)?nèi)容1， 使用我們現(xiàn)有的Oct4GFP及StellaGFP胚胎干細(xì)胞株, 結(jié)合其它PGC特異性分子標(biāo)記，利用無(wú)血清培養(yǎng)方式, 優(yōu)化促進(jìn)PGC形成的最佳體外條件；并以gonadal細(xì)胞共培養(yǎng)的方式建立適合PGC生長(zhǎng)的微環(huán)境。分析核受體RAR/RXR復(fù)合體在精原細(xì)胞中的特異性及其調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的機(jī)理。4, 探討在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過(guò)程中，以上信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的適用性。研究?jī)?nèi)容：1, 以一些PGC表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控元，如Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad為研究對(duì)象, 運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)及BiFC組學(xué)平臺(tái), 系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)直接與關(guān)鍵調(diào)控元相互作用的蛋白, 并依此建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本課題設(shè)置上緊密圍繞干細(xì)胞誘導(dǎo)生成生殖細(xì)胞這一重大科學(xué)問(wèn)題，以研究誘導(dǎo)分化技術(shù)、蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、減數(shù)分裂機(jī)理以及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育為主線，將各個(gè)課題有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，使各方面的研究工作既具有明確的研究目標(biāo)，同時(shí)又相互緊密聯(lián)系，形成我國(guó)在這一前沿領(lǐng)域的研究特色。6，課題間的相互關(guān)系本項(xiàng)目以中山大學(xué)為主體，聯(lián)合中國(guó)科學(xué)學(xué)院，華東師范大學(xué)及中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位，圍繞總體研究目標(biāo)，本項(xiàng)目設(shè)立4個(gè)課題組，研究過(guò)程中相互配合、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提倡資源共享。顧問(wèn)專家由相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域成就卓著的專家組成，承擔(dān)單位之外的專家占絕大多數(shù)。瞄準(zhǔn)戰(zhàn)略目標(biāo)，統(tǒng)一思路，力求持續(xù)發(fā)展。同時(shí)，通過(guò)建立大型經(jīng)濟(jì)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞，研究在體外特定條件下的分化潛能，嘗試培育生長(zhǎng)性能好、環(huán)境友好型、品質(zhì)優(yōu)良的新品種。本項(xiàng)目的選題涉及干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過(guò)程中重要蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；雄性生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)理；胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化的體系及機(jī)理；干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育上的應(yīng)用等科學(xué)問(wèn)題。4，創(chuàng)新點(diǎn)本項(xiàng)目探討影響國(guó)計(jì)民生的的重大科學(xué)問(wèn)題。本項(xiàng)目注重各研究課題之間的配合、確保信息共享，發(fā)揮專業(yè)交叉、知識(shí)互補(bǔ)、團(tuán)結(jié)協(xié)作的精神，確保本項(xiàng)目圓滿、順利完成。研究課題所用的方法和材料都是本項(xiàng)目組成員多年應(yīng)用、被證明是行之有效的方法；而且，我們的課題組