【正文】 胞向生殖細胞分化機理產(chǎn)生功能性配子與克隆動物建立以PGC關鍵調(diào)控元為中心的信號調(diào)控網(wǎng)絡全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾在PGC形成中的功能與調(diào)控機制闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向PGC誘導過程中的作用與機 理探索誘導分化的生殖細胞的生物學功能及其對小鼠胚胎發(fā)育的影響比較ESC和SSC DNA甲基化模式、基因表達和細胞表面蛋白成分的差 異檢索RA信號調(diào)控的靶基因,分析減數(shù)分裂的機 理探討在誘導牛干細胞向生殖細胞分化過程中信號調(diào)控網(wǎng)絡課題3. 誘導胚胎干細胞向原始生殖細胞分化的體系及機理研究優(yōu)化促進PGC形成的最佳體外培養(yǎng)條 件探討關鍵基因在小鼠PGC特化過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式創(chuàng)建表達標志PGC特化的報告基因體 系，探討關鍵信號網(wǎng)絡的調(diào)控機 理課題4. 干細胞向生殖細胞誘導分化技術(shù)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物培育上的應用建立合適的牛ESC體外培養(yǎng)體系利用創(chuàng)建的牛ESC體系，探討牛干細胞自我更新和分化的途徑誘導牛ESC分化為雄性生殖細胞建立以ESC體外誘導分化為功能性生殖細胞的技術(shù)平臺課題1，干細胞向生殖細胞分化過程中重要蛋白調(diào)控網(wǎng)絡的解析研究目標：建立和完善高通量研究蛋白互動網(wǎng)絡以及干細胞向生殖細胞分化的技術(shù)平臺，包括蛋白質(zhì)組學平臺，BiFC組學平臺, 基因組學平臺，生物信息學平臺。從表觀遺傳學著手，研究PGC誘導過程中組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與PGC或精子發(fā)育之間的相互關系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾（著重于組蛋白?；⒓谆难芯浚┰赑GC形成中的功能與調(diào)控機制。研究內(nèi)容：1， 利用測序的方法（如CpG二核苷酸位點上的甲基化），cDNA基因芯片的篩選，蛋白質(zhì)組學和質(zhì)譜分析技術(shù)，系統(tǒng)地比較胚胎干細胞和精原干細胞DNA甲基化模式、基因表達和細胞表面蛋白成分的差異。課題承擔單位：中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院課題負責人： 楊東山 副研究員（中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）主要學術(shù)骨干：戚華宇 研究員 （中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院） 謝 亭 教授 （中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院） 徐仁和 教授 （中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）課題經(jīng)費比例：占申請經(jīng)費的23%。 3， 在人胚胎干細胞中創(chuàng)建穩(wěn)定表達標志PGC特化的報告基因體系 (Blimp1GFP和StellaGFP等)，以有效地監(jiān)測PGC的形成，并利用此體系，優(yōu)化從人胚胎干細胞誘導分化PGC的條件，探討關鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號網(wǎng)絡的調(diào)控機理。4， 以其它子課題的蛋白網(wǎng)絡調(diào)控等相關研究為基礎，利用創(chuàng)建的牛ES細胞體系，探討牛干細胞自我更新和分化的途徑。2，檢測不同生長因子的誘導作用,并嘗試體外誘導PGC減數(shù)分裂形成功能性配子。6，建立特定基因過量表達或缺失的轉(zhuǎn)基因及基因敲除載體。2， 分離獲得小鼠精原干細胞；初步完成精子前體細胞中生物信息學分析，確定23個受視黃酸誘導調(diào)控并參與減數(shù)分裂調(diào)控的目標基因。6， 構(gòu)建小鼠配子中特異表達的Gpr126等35個重要基因的條件敲除載體或轉(zhuǎn)基因載體。10， 撰寫論文12篇。4， 利用測序的方法（如CpG二核苷酸位點上的甲基化）分析精原干細胞和胚胎干細胞的基因組DNA，印跡基因和一些關鍵的多能性基因的DNA甲基化模式。6， 建立清除內(nèi)源精原干細胞的野生型小鼠或缺失精原干細胞的突變型小鼠，用于曲細精管注射檢測體外培養(yǎng)的精原干細胞的生物學功能。9， 在優(yōu)化的體外培養(yǎng)條件下誘導ESC向PGC分化，運用基因芯片和定量PCR等技術(shù)篩選PGC特異的基因（主要是GPCR和其他受體介導的信號傳導分子）并研究其表達模式。13， 探索已建立的牛胚胎干細胞體外培養(yǎng)條件可否適合體外來源的牛胚胎（體外受精胚胎和體外克隆胚胎）的可行性。3， 完成精原干細胞和胚胎干細胞、誘導多能干細胞的DNA甲基化測序。7， 在無血清培養(yǎng)條件下，建立ESC向PGC分化的最佳體外培養(yǎng)體系。11， 建立特定基因過表達和knockdown的ES細胞株，得到嵌合體小鼠（第一批）。15， 與其他子課題的蛋白網(wǎng)絡調(diào)控等相關研究為基礎，初步闡明LIFSTAT3等信號通路在維持ES細胞自我更新中的作用。3， 全面篩選與組蛋白修飾相關的基因，通過基因敲除或過量表達，驗證不同修飾與PGC或精子發(fā)育之間的相互關系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾（著重于組蛋白?；?、甲基化的研究）在PGC形成中的功能與調(diào)控機制。6， 根據(jù)精原干細胞與胚胎干細胞差異分析的初步結(jié)果，在已知的實驗條件基礎上改進，以期找出胚胎干細胞體外誘導精子細胞的更有效方法。11， 已建立的不同胚胎來源（體內(nèi)胚胎、體外受精胚胎和克隆胚胎）的牛ES細胞進行基因表達分析。3，揭示組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與PGC發(fā)育之間的相互關系。利用卵母細胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法驗證誘導分化的生殖細胞的能力。從兩種細胞中分離出的RNA與小鼠的表達DNA陣列雜交，以檢測基因表達的上調(diào)或下降。6， 利用上述人胚胎干細胞中創(chuàng)建PGC特化的報告基因體系及PGC生成的培養(yǎng)體系，優(yōu)化從人胚胎干細胞誘導分化PGC的條件，探討關鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號網(wǎng)絡的調(diào)控機理。預期目標：1， 明確端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向PGC誘導過程中的作用機理。5， 完成第一批小鼠模型的表型分析和機理研究。10， 撰寫論文810篇，申請專利13項。3， 綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細胞減數(shù)分裂的機制。7， 牛ES細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎體內(nèi)發(fā)育能力，并與體內(nèi)來源胚胎在體內(nèi)正常發(fā)育進行比較研究。3，完成第二批小鼠動物模型表型分析和機理研究；4，重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機理研究；5，將牛ES細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎移植于同期誘導發(fā)情的母體內(nèi)，力爭獲得后代。內(nèi)容總結(jié)
（1）一、研究內(nèi)容
本項目將以胚胎干細胞及誘導多能干細胞（iPS）為技術(shù)平臺，研究哺乳動物干細胞向生殖細胞分化以及生殖細胞減數(shù)分裂的調(diào)控網(wǎng)絡和機理，并建立研究生殖細胞分化所需的生物技術(shù)平臺及多種細胞及小鼠模型，從而提高干細胞向生殖細胞誘導分化的效率，為大型經(jīng)濟動物優(yōu)質(zhì)培育奠定基礎