【正文】 鼠后代。10， 鑒定ESC分化為PGC個階段的差異表達基因，明確它們的表達模式。14， 建立13個具備生殖嵌合能力的牛胚胎干細胞系。2， 利用貝葉斯網(wǎng)絡推測組蛋白各種不同修飾和基因表達之間的因果關(guān)系及組合關(guān)系，并推測組蛋白修飾相互之間形成的邏輯關(guān)系。利用所構(gòu)建的相關(guān)載體、DNA文庫篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。8， 在第一和第二課題篩選的在PGC特化和配子減數(shù)分裂過程中有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子或輔因子中，選擇幾個代表性基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因或基因敲除載體，篩選基因打靶的ES細胞株；9， 對已構(gòu)建的小鼠模型進行表型分析，鑒定目的基因的生理功能和下游信號傳導途徑；10， 研究參與PGC特化的生長因子和激素等細胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控的分子機理，進一步優(yōu)化培養(yǎng)體系。2，發(fā)現(xiàn)若干個新的調(diào)控干細胞向生殖細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子。11，初步建立牛ES細胞體外定向誘導分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的技術(shù)體系。2， 通過cDNA基因芯片篩選的方法系統(tǒng)分析胚胎干細胞（誘導多能干細胞）和精原干細胞的基因表達譜。5， 建立特定基因過量表達或缺失的小鼠純合體模型, 并研究上述特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞及小鼠純合體的表型及對PGC及功能性配子形成的影響，探討關(guān)鍵基因（如激素受體）在小鼠PGC特化及減數(shù)分裂形成功能性配子過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。8， 召開國際生殖學研討會。4， 體外誘導分化獲得生殖細胞，并通過卵母細胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代。9， 召開一次生殖學研討會。2， 通過蛋白組學，分離，純化胚胎干細胞和精原干細胞的細胞膜成分，利用蛋白雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析，深入研究細胞表面蛋白表達的差別，綜合前四年研究結(jié)果分析胚胎干細胞和精原干細胞在DNA甲基化模式、基因表達和細胞表面蛋白成分的差異，闡明造成精原干細胞和胚胎干細胞的不同發(fā)育潛力的主要原因。6， 結(jié)合其他課題組的研究成果,利用已完善的PGC及功能性配子誘導體系,檢測新發(fā)現(xiàn)的重要基因(如Oct4,Nanog的相互作用分子等)的功能及分子作用機理。2，完成胚胎干細胞（誘導多能干細胞）和精原干細胞表面蛋白表達的檢測和比較；綜合前四年研究結(jié)果，闡明造成精原干細胞和胚胎干細胞的不同發(fā)育潛力的主要原因；綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細胞減數(shù)分裂的機制；完成對卵母細胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代的表型分析。7， 整理論文810篇，申請專利35項。6， 比較分析兩種胚胎生成后代牛的異同，初步闡明以牛ES細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎是否具備可行性和優(yōu)越性。8， 總結(jié)研究結(jié)果，匯總數(shù)據(jù)，提交研究報告，撰寫論文。4， 進一步研究體外誘導分化的生殖細胞通過胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得的后代的表型及生理功能，評估體外誘導分化獲得的生殖細胞對其后代的影響。第五年：1， 利用以上的研究手法，與課題4共同篩選在誘導牛干細胞分化過程中的Nanog, Oct4，RAR/RXR的結(jié)合蛋白，檢索調(diào)控Blimp1 、Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa等基因表達的調(diào)控因子。6， 初步完成重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機理研究。2， 完成胚胎干細胞（誘導多能干細胞）和精原干細胞的基因表達譜的檢測和比較。7， 利用卵母細胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法對誘導分化的生殖細胞所形成的囊胚進行分子生物學、生理學分析及安全性檢測。3， 對視黃酸在生殖細胞中的受體及輔助受體復合物的形成及其中各成分的生物學功能的分子調(diào)節(jié)機制加以研究。12，撰寫論文810篇，申請專利12項。4，完成精原干細胞和胚胎干細胞（誘導多能干細胞）組蛋白修飾模式的檢測和比較；5，完成生物信息學分析結(jié)果確定的相關(guān)基因?qū)毎麥p數(shù)分裂的影響研究，初步完成相關(guān)載體、DNA文庫的構(gòu)建，篩選與視黃素受體相互作用的蛋白，確定12個參與減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的新基因；6，體外誘導胚胎干細胞（誘導多能干細胞）產(chǎn)生具有精子分化表型的精原細胞，并通過小鼠曲細精管注射實驗，檢測體外誘導分化所得精原細胞形成克隆的能力，通過體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測其衍生細胞的受精和支持胚胎發(fā)育的能力。12， 探索牛ES細胞體外定向誘導分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的能力。7， 利用小鼠曲細精管注射實驗，檢測體外誘導分化所得精原干細胞形成克隆的能力，通過分子和細胞生物學的方法檢測其衍生細胞。4， 用特定的抗體通過Western 雜交和免疫細胞化學的方法比較精原干細胞和胚胎干細胞中與控制基因表達相關(guān)的組蛋白修飾模式的差異，如H3K4me，H3K9me等。16， 撰寫論文68篇，申請專利1項。12， 獲得3個以上特定基因敲除的小鼠干細胞品系。8， 鑒定PGC參與調(diào)節(jié)ESC特化為PGC過程中的生長因子、激素或小分子化合物。4， 完成對精原干細胞的基因芯片分析，確定23個受視黃酸刺激表達明顯上調(diào)的基因。14， 利用創(chuàng)建的牛ES細胞體系，初步探討牛ES細胞自我更新和分化途徑。10， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞株或小鼠雜合體模型。建立穩(wěn)定的胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)平臺。5， 對經(jīng)過視黃酸刺激的精原干細胞進行基因芯片分析來研究其表達譜。第二年：1， 在前年度研究結(jié)果的基礎上，繼續(xù)完善體外胚胎干細胞（誘導多能干細胞）誘導分化精子細胞的有效途徑，利用已知精原干細胞的標志基因以及帶有精子前體細胞熒光標記蛋白的小鼠對體外誘導產(chǎn)生的細胞加以檢驗。7， 構(gòu)建Blimp1GFP和StellaGFP等PGC特化報告基因穩(wěn)定表達的人胚胎干細胞。3， 初步建立胚胎干細胞（或誘導多能干細胞）體外培養(yǎng)和誘導分化的培養(yǎng)體系。7，在人胚胎干細胞中創(chuàng)建穩(wěn)定表達標志PGC特化的報告基因體系。3，利用蛋白質(zhì)組學及BiFC組學研究技術(shù), 系統(tǒng)地從human ORFeome (12000 個基因) 或其他逆轉(zhuǎn)錄病毒表達庫中篩選直接與Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad相互作用的蛋白。5， 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)、選擇合適的生長因子、轉(zhuǎn)錄因子和培養(yǎng)體系誘導牛ES細胞分化為雄性生殖細胞，為經(jīng)濟動物的改良服務。課題承擔單位： 華東師范大學課題負責人： 王 媛 特聘教授