【正文】 上。具體地，本項(xiàng)目將首先建立能夠系統(tǒng)挖掘生殖細(xì)胞靶蛋白及其體外誘導(dǎo)分化的技術(shù)手段與平臺(tái)，包括：蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)、蛋白質(zhì)BiFC表達(dá)庫(kù)和RNAi庫(kù)、生物信息學(xué)技術(shù)平臺(tái)和動(dòng)物模型技術(shù)平臺(tái)。其次，項(xiàng)目承擔(dān)單位具有良好的研究條件和基礎(chǔ)，并且已經(jīng)具備了相當(dāng)?shù)囊?guī)模、取得了很好的科研成果。項(xiàng)目中的四個(gè)子課題既相互獨(dú)立，又交叉互補(bǔ)。這些可為人類(lèi)提供高品質(zhì)食源，具有非常明顯的創(chuàng)新性。(2) 在研究方面，不只停留在單項(xiàng)技術(shù)或研究手段上，而是發(fā)展綜合技術(shù)平臺(tái)及多種細(xì)胞和動(dòng)物模型。本項(xiàng)目期望在誘導(dǎo)干細(xì)胞生成生殖細(xì)胞關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題上取得重大突破性成果，保證按期完成項(xiàng)目的總體目標(biāo)和五年目標(biāo)。課題承擔(dān)單位： 中山大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 松陽(yáng)洲 教授 （中山大學(xué)）主要學(xué)術(shù)骨干： 張 雁 教授 （中山大學(xué)）項(xiàng) 鵬 教授 （中山大學(xué)） 周天壽 教授 （中山大學(xué)） 張勤奮 副教授 （中山大學(xué)）王繼剛 講師 （華東師范大學(xué)）李鯤鵬 講師 （中山大學(xué)）課題經(jīng)費(fèi)比例： 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的31% 課題2，雄性生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)理研究研究目標(biāo)：通過(guò)對(duì)精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的表觀遺傳，基因表達(dá)和表面蛋白差異的系統(tǒng)分析，對(duì)視黃素(RA)信號(hào)通路及其在精子生成細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂功能的特異性分析，闡述精原干細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，為干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化雄性生殖細(xì)胞提供依據(jù)。2， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立特定基因過(guò)量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞株及小鼠模型，探討關(guān)鍵基因（如激素受體及BMP家族）在小鼠PGC特化過(guò)程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。課題承擔(dān)單位： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 朱 捷 教授 （中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)）主要學(xué)術(shù)骨干： 陳瑤生 教授 （中山大學(xué)）周光斌 副教授 （中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)） 于政權(quán) 副教授 （中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)）課題經(jīng)費(fèi)比例 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的23%四、年度計(jì)劃第一年：1, 建立較為理想的從小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)PGC形成的培養(yǎng)體系。預(yù)期目標(biāo)：1， 建立和完善高通量研究蛋白互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)平臺(tái)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)，BiFC組學(xué)平臺(tái), 基因組學(xué)平臺(tái)，生物信息學(xué)平臺(tái)。9， 建立牛胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。設(shè)計(jì)、構(gòu)建相關(guān)載體、DNA文庫(kù)，用以篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。12， 進(jìn)一步探索已建立的牛類(lèi)胚干細(xì)胞系體外分化為三個(gè)胚層的能力及種系嵌合的研究。6， 獲得清除內(nèi)源精原干細(xì)胞的野生型小鼠或缺失精原干細(xì)胞的突變型小鼠，獲得精子注射小鼠后代。14， 建立13個(gè)具備生殖嵌合能力的牛胚胎干細(xì)胞系。利用所構(gòu)建的相關(guān)載體、DNA文庫(kù)篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。2，發(fā)現(xiàn)若干個(gè)新的調(diào)控干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子。2， 通過(guò)cDNA基因芯片篩選的方法系統(tǒng)分析胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞的基因表達(dá)譜。8， 召開(kāi)國(guó)際生殖學(xué)研討會(huì)。9， 召開(kāi)一次生殖學(xué)研討會(huì)。6， 結(jié)合其他課題組的研究成果,利用已完善的PGC及功能性配子誘導(dǎo)體系,檢測(cè)新發(fā)現(xiàn)的重要基因(如Oct4,Nanog的相互作用分子等)的功能及分子作用機(jī)理。7， 整理論文810篇，申請(qǐng)專(zhuān)利35項(xiàng)。8， 總結(jié)研究結(jié)果，匯總數(shù)據(jù)，提交研究報(bào)告，撰寫(xiě)論文。第五年：1， 利用以上的研究手法，與課題4共同篩選在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞分化過(guò)程中的Nanog, Oct4，RAR/RXR的結(jié)合蛋白，檢索調(diào)控Blimp1 、Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa等基因表達(dá)的調(diào)控因子。2， 完成胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞的基因表達(dá)譜的檢測(cè)和比較。3， 對(duì)視黃酸在生殖細(xì)胞中的受體及輔助受體復(fù)合物的形成及其中各成分的生物學(xué)功能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制加以研究。4，完成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）組蛋白修飾模式的檢測(cè)和比較；5，完成生物信息學(xué)分析結(jié)果確定的相關(guān)基因?qū)?xì)胞減數(shù)分裂的影響研究，初步完成相關(guān)載體、DNA文庫(kù)的構(gòu)建，篩選與視黃素受體相互作用的蛋白，確定12個(gè)參與減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的新基因；6，體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）產(chǎn)生具有精子分化表型的精原細(xì)胞，并通過(guò)小鼠曲細(xì)精管注射實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)體外誘導(dǎo)分化所得精原細(xì)胞形成克隆的能力，通過(guò)體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測(cè)其衍生細(xì)胞的受精和支持胚胎發(fā)育的能力。7， 利用小鼠曲細(xì)精管注射實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)體外誘導(dǎo)分化所得精原干細(xì)胞形成克隆的能力，通過(guò)分子和細(xì)胞生物學(xué)的方法檢測(cè)其衍生細(xì)胞。16， 撰寫(xiě)論文68篇，申請(qǐng)專(zhuān)利1項(xiàng)。8， 鑒定PGC參與調(diào)節(jié)ESC特化為PGC過(guò)程中的生長(zhǎng)因子、激素或小分子化合物。14， 利用創(chuàng)建的牛ES細(xì)胞體系，初步探討牛ES細(xì)胞自我更新和分化途徑。建立穩(wěn)定的胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)平臺(tái)。第二年：1， 在前年度研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)完善體外胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）誘導(dǎo)分化精子細(xì)胞的有效途徑，利用已知精原干細(xì)胞的標(biāo)志基因以及帶有精子前體細(xì)胞熒光標(biāo)記蛋白的小鼠對(duì)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞加以檢驗(yàn)。3， 初步建立胚胎干細(xì)胞（或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)體系。3，利用蛋白質(zhì)組學(xué)及BiFC組學(xué)研究技術(shù), 系統(tǒng)地從human ORFeome (12000 個(gè)基因) 或其他逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)庫(kù)中篩選直接與Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad相互作用的蛋白。課題承擔(dān)單位： 華東師范大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 王 媛 特聘教授 （華東師范大學(xué)）主要學(xué)術(shù)骨干： 李大力 副研究員 （華東師范大學(xué)）周文良 教授 （中山大學(xué)）葉希韻 副教授 （華東師范大學(xué)）課題經(jīng)費(fèi)比例： 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的23%。2，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，利用RAR/RXR在DNA結(jié)合區(qū)域的序列保守性，檢索精子前體細(xì)胞中RA信號(hào)調(diào)控的靶基因。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)若干新的調(diào)控干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子，在整體細(xì)胞水平上初步確立干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。不但充分發(fā)揮子課題各承擔(dān)單位的技術(shù)和學(xué)科優(yōu)勢(shì)，而且加強(qiáng)優(yōu)勢(shì)力量的