【正文】 mp1GFP和StellaGFP等PGC特化報告基因穩(wěn)定表達的人胚胎干細胞。8， 獲得促使牛ICM細胞體外維持多能性的最佳細胞因子組合，建立8個體外培養(yǎng)生長狀況良好、表達干細胞標(biāo)記的牛類胚胎干細胞系。9， 建立牛胚胎干細胞體外培養(yǎng)體系。10， 撰寫論文12篇。第二年：1， 在前年度研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)完善體外胚胎干細胞（誘導(dǎo)多能干細胞）誘導(dǎo)分化精子細胞的有效途徑，利用已知精原干細胞的標(biāo)志基因以及帶有精子前體細胞熒光標(biāo)記蛋白的小鼠對體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞加以檢驗。2， 通過過量表達或RNAi的研究手法，從PGC或生殖母細胞調(diào)控元及與其相互作用的蛋白質(zhì)組中篩選出控制Blimp1, Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa和DAZL基因表達的關(guān)鍵因子。3， 利用生物信息學(xué)研究手法，建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。4， 利用測序的方法（如CpG二核苷酸位點上的甲基化）分析精原干細胞和胚胎干細胞的基因組DNA，印跡基因和一些關(guān)鍵的多能性基因的DNA甲基化模式。5， 對經(jīng)過視黃酸刺激的精原干細胞進行基因芯片分析來研究其表達譜。利用特定的抗體進行免疫沉淀或染色質(zhì)免疫沉淀對視黃酸在生殖細胞中的受體、輔助受體復(fù)合物進行生化分析。設(shè)計、構(gòu)建相關(guān)載體、DNA文庫，用以篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。6， 建立清除內(nèi)源精原干細胞的野生型小鼠或缺失精原干細胞的突變型小鼠，用于曲細精管注射檢測體外培養(yǎng)的精原干細胞的生物學(xué)功能。建立穩(wěn)定的胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)平臺。7， 通過報告基因和表面抗原標(biāo)記，篩選在體外培養(yǎng)體系中參與PGC特化的生長因子和激素等細胞外因子或小分子化合物。8， 以gonadal細胞共培養(yǎng)的方式建立適合PGC生長及減數(shù)分裂形成功能性配子的微環(huán)境。9， 在優(yōu)化的體外培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)ESC向PGC分化，運用基因芯片和定量PCR等技術(shù)篩選PGC特異的基因（主要是GPCR和其他受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)分子）并研究其表達模式。10， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞株或小鼠雜合體模型。11， 利用上述人胚胎干細胞中創(chuàng)建PGC特化的報告基因體系, 建立完善從人胚胎干細胞誘導(dǎo)PGC生成的培養(yǎng)體系。12， 進一步探索已建立的牛類胚干細胞系體外分化為三個胚層的能力及種系嵌合的研究。13， 探索已建立的牛胚胎干細胞體外培養(yǎng)條件可否適合體外來源的牛胚胎（體外受精胚胎和體外克隆胚胎）的可行性。14， 利用創(chuàng)建的牛ES細胞體系，初步探討牛ES細胞自我更新和分化途徑。預(yù)期目標(biāo)：1， 篩選出控制PGC基因表達的68個關(guān)鍵因子。2， 建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3， 完成精原干細胞和胚胎干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞的DNA甲基化測序。4， 完成對精原干細胞的基因芯片分析，確定23個受視黃酸刺激表達明顯上調(diào)的基因。5， 對視黃酸受體、輔助受體復(fù)合物進行生化分析，確定其基本成分；設(shè)計、構(gòu)建用于篩選相關(guān)蛋白相互作用的載體、DNA文庫。6， 獲得清除內(nèi)源精原干細胞的野生型小鼠或缺失精原干細胞的突變型小鼠，獲得精子注射小鼠后代。7， 在無血清培養(yǎng)條件下，建立ESC向PGC分化的最佳體外培養(yǎng)體系。8， 鑒定PGC參與調(diào)節(jié)ESC特化為PGC過程中的生長因子、激素或小分子化合物。9， 建立適合PGC生長及減數(shù)分裂的gonadal細胞共培養(yǎng)體系。10， 鑒定ESC分化為PGC個階段的差異表達基因，明確它們的表達模式。11， 建立特定基因過表達和knockdown的ES細胞株，得到嵌合體小鼠（第一批）。12， 獲得3個以上特定基因敲除的小鼠干細胞品系。13， 完善從人胚胎干細胞誘導(dǎo)PGC生成的培養(yǎng)體系。14， 建立13個具備生殖嵌合能力的牛胚胎干細胞系。15， 與其他子課題的蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等相關(guān)研究為基礎(chǔ)，初步闡明LIFSTAT3等信號通路在維持ES細胞自我更新中的作用。16， 撰寫論文68篇，申請專利1項。第三年：1， 利用高通量的染色體免疫沉淀結(jié)合全基因組DNA芯片或短序列測序技術(shù)（“ChIPchip”和“ChIPseq”），研究PGC誘導(dǎo)過程中組蛋白修飾的動態(tài)過程。2， 利用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)推測組蛋白各種不同修飾和基因表達之間的因果關(guān)系及組合關(guān)系，并推測組蛋白修飾相互之間形成的邏輯關(guān)系。3， 全面篩選與組蛋白修飾相關(guān)的基因，通過基因敲除或過量表達，驗證不同修飾與PGC或精子發(fā)育之間的相互關(guān)系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾（著重于組蛋白酰基化、甲基化的研究）在PGC形成中的功能與調(diào)控機制。4， 用特定的抗體通過Western 雜交和免疫細胞化學(xué)的方法比較精原干細胞和胚胎干細胞中與控制基因表達相關(guān)的組蛋白修飾模式的差異，如H3K4me，H3K9me等。5， 根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，挑選幾個相關(guān)基因開展分子、細胞等方面的生物學(xué)實驗詳細檢測它們對精原細胞減數(shù)分裂的影響。利用所構(gòu)建的相關(guān)載體、DNA文庫篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。6， 根據(jù)精原干細胞與胚胎干細胞差異分析的初步結(jié)果，在已知的實驗條件基礎(chǔ)上改進，以期找出胚胎干細胞體外誘導(dǎo)精子細胞的更有效方法。7， 利用小鼠曲細精管注射實驗，檢測體外誘導(dǎo)分化所得精原干細胞形成克隆的能力，通過分子和細胞生物學(xué)的方法檢測其衍生細胞。通過體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測其衍生細胞的生物學(xué)功能。8， 在第一和第二課題篩選的在PGC特化和配子減數(shù)分裂過程中有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子或輔因子中，選擇幾個代表性基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因或基因敲除載體，篩選基因打靶的ES細胞株；9， 對已構(gòu)建的小鼠模型進行表型分析，鑒定目的基因的生理功能和下游信號傳導(dǎo)途徑；10， 研究參與PGC特化的生長因子和激素等細胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控的分子機理，進一步優(yōu)化培養(yǎng)體系。11， 已建立的不同胚胎來源（體內(nèi)胚胎、體外受精胚胎和克隆胚胎）的牛ES細胞進行基因表達分析。12， 探索牛ES細胞體外定向誘導(dǎo)分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的能力。預(yù)期目標(biāo)：1，把握PGC誘導(dǎo)過程中組蛋白修飾的動態(tài)過程。2，發(fā)現(xiàn)若干個新的調(diào)控干細胞向生殖細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子。3，揭示組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與PGC