【正文】 ， 獲得3個以上特定基因敲除的小鼠干細胞品系。4， 用特定的抗體通過Western 雜交和免疫細胞化學的方法比較精原干細胞和胚胎干細胞中與控制基因表達相關的組蛋白修飾模式的差異，如H3K4me，H3K9me等。12， 探索牛ES細胞體外定向誘導分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的能力。12，撰寫論文810篇，申請專利12項。7， 利用卵母細胞帶下注射或胞質注射的方法對誘導分化的生殖細胞所形成的囊胚進行分子生物學、生理學分析及安全性檢測。6， 初步完成重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機理研究。4， 進一步研究體外誘導分化的生殖細胞通過胞漿內(nèi)精子注射技術獲得的后代的表型及生理功能，評估體外誘導分化獲得的生殖細胞對其后代的影響。6， 比較分析兩種胚胎生成后代牛的異同，初步闡明以牛ES細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎是否具備可行性和優(yōu)越性。2，完成胚胎干細胞（誘導多能干細胞）和精原干細胞表面蛋白表達的檢測和比較；綜合前四年研究結果，闡明造成精原干細胞和胚胎干細胞的不同發(fā)育潛力的主要原因；綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細胞減數(shù)分裂的機制；完成對卵母細胞胞漿內(nèi)精子注射技術獲得后代的表型分析。2， 通過蛋白組學，分離，純化胚胎干細胞和精原干細胞的細胞膜成分，利用蛋白雙向凝膠電泳技術和質譜分析，深入研究細胞表面蛋白表達的差別，綜合前四年研究結果分析胚胎干細胞和精原干細胞在DNA甲基化模式、基因表達和細胞表面蛋白成分的差異，闡明造成精原干細胞和胚胎干細胞的不同發(fā)育潛力的主要原因。4， 體外誘導分化獲得生殖細胞，并通過卵母細胞胞漿內(nèi)精子注射技術獲得后代。5， 建立特定基因過量表達或缺失的小鼠純合體模型, 并研究上述特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞及小鼠純合體的表型及對PGC及功能性配子形成的影響，探討關鍵基因（如激素受體）在小鼠PGC特化及減數(shù)分裂形成功能性配子過程中的功能及體內(nèi)轉錄調(diào)控模式。11，初步建立牛ES細胞體外定向誘導分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的技術體系。8， 在第一和第二課題篩選的在PGC特化和配子減數(shù)分裂過程中有重要功能的轉錄因子或輔因子中，選擇幾個代表性基因構建轉基因或基因敲除載體，篩選基因打靶的ES細胞株；9， 對已構建的小鼠模型進行表型分析，鑒定目的基因的生理功能和下游信號傳導途徑；10， 研究參與PGC特化的生長因子和激素等細胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控的分子機理，進一步優(yōu)化培養(yǎng)體系。2， 利用貝葉斯網(wǎng)絡推測組蛋白各種不同修飾和基因表達之間的因果關系及組合關系，并推測組蛋白修飾相互之間形成的邏輯關系。10， 鑒定ESC分化為PGC個階段的差異表達基因，明確它們的表達模式。2， 建立以PGC關鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號調(diào)控網(wǎng)絡。8， 以gonadal細胞共培養(yǎng)的方式建立適合PGC生長及減數(shù)分裂形成功能性配子的微環(huán)境。3， 利用生物信息學研究手法，建立以PGC關鍵調(diào)控元為中心的信號調(diào)控網(wǎng)絡。5， 成功誘導小鼠胚胎干細胞分化成為PGC，檢測RA、BMP等5種以上信號分子對PGC分化的影響。5，開展小鼠曲細精管注射及卵母細胞胞漿注射實驗，建立精原干細胞和精子細胞的功能檢測體系，以便于對體外誘導分化所得精原（精子）細胞的生物學功能加以驗證。研究內(nèi)容：1，參照人和動物ES細胞建系的技術，選用不同胚齡及各種附植前牛胚胎的內(nèi)細胞團，建立合適的牛ES細胞體外培養(yǎng)體系。3．利用全細胞成像及分子生物學技術分析誘導分化的雄性生殖細胞，通過小鼠曲細精管內(nèi)細胞注射和卵細胞胞漿內(nèi)精子注射，探索體外誘導分化的生殖細胞的生物學功能及其對小鼠胚胎發(fā)育的影響。2, 以Blimp1 、Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa和DAZL等重要的PGC表達基因為模式， 從PGC或生殖母細胞調(diào)控元及與其相互作用的蛋白質組中篩選出控制這些基因表達的關鍵因子。本項目的執(zhí)行采用首席科學家負責制。項目規(guī)劃管理和運作體制包括總項目和子課題兩個層次。將基礎科學與實際應用相結合，力爭在解答基礎科學問題的同時，發(fā)展新的動物繁殖技能。其三，承擔本項目研究工作的中堅力量和學術骨干多數(shù)是新近從海外留學工作歸國的成績卓著的中青年科學家，擁有豐富的研究成果和研究經(jīng)驗，多次在國際著名專業(yè)雜志上發(fā)表論文。首先，本項目提出的主要科學問題和研究目標不僅具有理論和實際依據(jù)，而且都是該領域前沿性和關鍵性的問題。三、研究方案1，總體思路干細胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能。6，建立一整套誘導PGC生成的培養(yǎng)體系。在建立的多種技術平臺的基礎上，確立以PGC關鍵調(diào)控元為中心的信號調(diào)控網(wǎng)絡，篩選控制PGC基因表達的關鍵因子。同時利用表觀遺傳學研究技術，分析PGC誘導過程中組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與PGC發(fā)育之間的相互關系。闡明雄性生殖細胞中誘導減數(shù)分裂的分子機制，建立干細胞體外誘導分化雄性生殖細胞的理論體系，并分析體外生成生殖細胞的生物學功能。五年預期目標1，發(fā)展基于干細胞學和生殖細胞學研究的一整套方法和綜合技術平臺。9，在國際重要學術刊物上發(fā)表高水平論文40篇以上。2，技術途徑根據(jù)以上的學術思路，本項目的總體研究技術途徑如圖2所示。研究課題所用的方法和材料都是本項目組成員多年應用、被證明是行之有效的方法；而且，我們的課題組成員積累了大量的關鍵性研究材料，如各種ES細胞系，iPS細胞，轉基因鼠，牛等，可為本項目的實施提供強有力的保證。4，創(chuàng)新點本項目探討影響國計民生的的重大科學問題。同時，通過建立大型經(jīng)濟動物胚胎干細胞，研究在體外特定條件下的分化潛能，嘗試培育生長性能好、環(huán)境友好型、品質優(yōu)良的新品種。顧問專家由相關學科領域成就卓著的專家組成，承擔單位之外的專家占絕大多數(shù)。本課題設置上緊密圍繞干細胞誘導生成生殖細胞這一重大科學問題，以研究誘導分化技術、蛋白調(diào)控網(wǎng)絡、減數(shù)分裂機理以及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物培育為主線，將各個課題有機地結合起來，使各方面的研究工作既具有明確的研究目標，同時又相互緊密聯(lián)系，形成我國在這一前沿領域的研究特色。4, 探討在誘導牛干細胞向生殖細胞分化過程中，以上信號調(diào)控網(wǎng)絡的適用性。研究內(nèi)容1， 使用我們現(xiàn)有的Oct4GFP及StellaGFP胚胎干細胞株, 結合其它PGC特異性分子標記，利用