【正文】 ， 獲得3個(gè)以上特定基因敲除的小鼠干細(xì)胞品系。4， 用特定的抗體通過Western 雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法比較精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中與控制基因表達(dá)相關(guān)的組蛋白修飾模式的差異，如H3K4me，H3K9me等。12， 探索牛ES細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的能力。12，撰寫論文810篇，申請(qǐng)專利12項(xiàng)。7， 利用卵母細(xì)胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法對(duì)誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞所形成的囊胚進(jìn)行分子生物學(xué)、生理學(xué)分析及安全性檢測。6， 初步完成重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機(jī)理研究。4， 進(jìn)一步研究體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞通過胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得的后代的表型及生理功能，評(píng)估體外誘導(dǎo)分化獲得的生殖細(xì)胞對(duì)其后代的影響。6， 比較分析兩種胚胎生成后代牛的異同，初步闡明以牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎是否具備可行性和優(yōu)越性。2，完成胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的檢測和比較；綜合前四年研究結(jié)果，闡明造成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的不同發(fā)育潛力的主要原因；綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的機(jī)制；完成對(duì)卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代的表型分析。2， 通過蛋白組學(xué)，分離，純化胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞的細(xì)胞膜成分，利用蛋白雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析，深入研究細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的差別，綜合前四年研究結(jié)果分析胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞在DNA甲基化模式、基因表達(dá)和細(xì)胞表面蛋白成分的差異，闡明造成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的不同發(fā)育潛力的主要原因。4， 體外誘導(dǎo)分化獲得生殖細(xì)胞，并通過卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代。5， 建立特定基因過量表達(dá)或缺失的小鼠純合體模型, 并研究上述特定基因過量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞及小鼠純合體的表型及對(duì)PGC及功能性配子形成的影響，探討關(guān)鍵基因（如激素受體）在小鼠PGC特化及減數(shù)分裂形成功能性配子過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。11，初步建立牛ES細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的技術(shù)體系。8， 在第一和第二課題篩選的在PGC特化和配子減數(shù)分裂過程中有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子或輔因子中，選擇幾個(gè)代表性基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因或基因敲除載體，篩選基因打靶的ES細(xì)胞株；9， 對(duì)已構(gòu)建的小鼠模型進(jìn)行表型分析，鑒定目的基因的生理功能和下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑；10， 研究參與PGC特化的生長因子和激素等細(xì)胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控的分子機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)體系。2， 利用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)推測組蛋白各種不同修飾和基因表達(dá)之間的因果關(guān)系及組合關(guān)系，并推測組蛋白修飾相互之間形成的邏輯關(guān)系。10， 鑒定ESC分化為PGC個(gè)階段的差異表達(dá)基因，明確它們的表達(dá)模式。2， 建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。8， 以gonadal細(xì)胞共培養(yǎng)的方式建立適合PGC生長及減數(shù)分裂形成功能性配子的微環(huán)境。3， 利用生物信息學(xué)研究手法，建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。5， 成功誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化成為PGC，檢測RA、BMP等5種以上信號(hào)分子對(duì)PGC分化的影響。5，開展小鼠曲細(xì)精管注射及卵母細(xì)胞胞漿注射實(shí)驗(yàn)，建立精原干細(xì)胞和精子細(xì)胞的功能檢測體系，以便于對(duì)體外誘導(dǎo)分化所得精原（精子）細(xì)胞的生物學(xué)功能加以驗(yàn)證。研究內(nèi)容：1，參照人和動(dòng)物ES細(xì)胞建系的技術(shù)，選用不同胚齡及各種附植前牛胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，建立合適的牛ES細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。3．利用全細(xì)胞成像及分子生物學(xué)技術(shù)分析誘導(dǎo)分化的雄性生殖細(xì)胞，通過小鼠曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞注射和卵細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射，探索體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞的生物學(xué)功能及其對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響。2, 以Blimp1 、Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa和DAZL等重要的PGC表達(dá)基因?yàn)槟Ｊ剑?從PGC或生殖母細(xì)胞調(diào)控元及與其相互作用的蛋白質(zhì)組中篩選出控制這些基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。本項(xiàng)目的執(zhí)行采用首席科學(xué)家負(fù)責(zé)制。項(xiàng)目規(guī)劃管理和運(yùn)作體制包括總項(xiàng)目和子課題兩個(gè)層次。將基礎(chǔ)科學(xué)與實(shí)際應(yīng)用相結(jié)合，力爭在解答基礎(chǔ)科學(xué)問題的同時(shí)，發(fā)展新的動(dòng)物繁殖技能。其三，承擔(dān)本項(xiàng)目研究工作的中堅(jiān)力量和學(xué)術(shù)骨干多數(shù)是新近從海外留學(xué)工作歸國的成績卓著的中青年科學(xué)家，擁有豐富的研究成果和研究經(jīng)驗(yàn)，多次在國際著名專業(yè)雜志上發(fā)表論文。首先，本項(xiàng)目提出的主要科學(xué)問題和研究目標(biāo)不僅具有理論和實(shí)際依據(jù)，而且都是該領(lǐng)域前沿性和關(guān)鍵性的問題。三、研究方案1，總體思路干細(xì)胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能。6，建立一整套誘導(dǎo)PGC生成的培養(yǎng)體系。在建立的多種技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上，確立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選控制PGC基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。同時(shí)利用表觀遺傳學(xué)研究技術(shù)，分析PGC誘導(dǎo)過程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過程和不同修飾與PGC發(fā)育之間的相互關(guān)系。闡明雄性生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂的分子機(jī)制，建立干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化雄性生殖細(xì)胞的理論體系，并分析體外生成生殖細(xì)胞的生物學(xué)功能。五年預(yù)期目標(biāo)1，發(fā)展基于干細(xì)胞學(xué)和生殖細(xì)胞學(xué)研究的一整套方法和綜合技術(shù)平臺(tái)。9，在國際重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文40篇以上。2，技術(shù)途徑根據(jù)以上的學(xué)術(shù)思路，本項(xiàng)目的總體研究技術(shù)途徑如圖2所示。研究課題所用的方法和材料都是本項(xiàng)目組成員多年應(yīng)用、被證明是行之有效的方法；而且，我們的課題組成員積累了大量的關(guān)鍵性研究材料，如各種ES細(xì)胞系，iPS細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因鼠，牛等，可為本項(xiàng)目的實(shí)施提供強(qiáng)有力的保證。4，創(chuàng)新點(diǎn)本項(xiàng)目探討影響國計(jì)民生的的重大科學(xué)問題。同時(shí)，通過建立大型經(jīng)濟(jì)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞，研究在體外特定條件下的分化潛能，嘗試培育生長性能好、環(huán)境友好型、品質(zhì)優(yōu)良的新品種。顧問專家由相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域成就卓著的專家組成，承擔(dān)單位之外的專家占絕大多數(shù)。本課題設(shè)置上緊密圍繞干細(xì)胞誘導(dǎo)生成生殖細(xì)胞這一重大科學(xué)問題，以研究誘導(dǎo)分化技術(shù)、蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、減數(shù)分裂機(jī)理以及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育為主線，將各個(gè)課題有機(jī)地結(jié)合起來，使各方面的研究工作既具有明確的研究目標(biāo)，同時(shí)又相互緊密聯(lián)系，形成我國在這一前沿領(lǐng)域的研究特色。4, 探討在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中，以上信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的適用性。研究內(nèi)容1， 使用我們現(xiàn)有的Oct4GFP及StellaGFP胚胎干細(xì)胞株, 結(jié)合其它PGC特異性分子標(biāo)記，利用