【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 （中山大學(xué)）王繼剛 講師 （華東師范大學(xué)）李鯤鵬 講師 （中山大學(xué)）課題經(jīng)費(fèi)比例： 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的31% 課題2，雄性生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)理研究研究目標(biāo)：通過(guò)對(duì)精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的表觀(guān)遺傳，基因表達(dá)和表面蛋白差異的系統(tǒng)分析，對(duì)視黃素(RA)信號(hào)通路及其在精子生成細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂功能的特異性分析，闡述精原干細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，為干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化雄性生殖細(xì)胞提供依據(jù)。研究?jī)?nèi)容：1， 利用測(cè)序的方法（如CpG二核苷酸位點(diǎn)上的甲基化），cDNA基因芯片的篩選，蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜分析技術(shù)，系統(tǒng)地比較胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞DNA甲基化模式、基因表達(dá)和細(xì)胞表面蛋白成分的差異。2，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，利用RAR/RXR在DNA結(jié)合區(qū)域的序列保守性，檢索精子前體細(xì)胞中RA信號(hào)調(diào)控的靶基因。分析核受體RAR/RXR復(fù)合體在精原細(xì)胞中的特異性及其調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的機(jī)理。3．利用全細(xì)胞成像及分子生物學(xué)技術(shù)分析誘導(dǎo)分化的雄性生殖細(xì)胞，通過(guò)小鼠曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞注射和卵細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射，探索體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞的生物學(xué)功能及其對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響。課題承擔(dān)單位：中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院課題負(fù)責(zé)人： 楊東山 副研究員（中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）主要學(xué)術(shù)骨干：戚華宇 研究員 （中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院） 謝 亭 教授 （中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院） 徐仁和 教授 （中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）課題經(jīng)費(fèi)比例：占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的23%。課題3， 誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化的體系及機(jī)理研究研究目標(biāo)：本課題將完善胚胎干細(xì)胞分化為PGC的技術(shù)體系，建立PGC特化過(guò)程中關(guān)鍵因子的轉(zhuǎn)基因及基因敲除的胚胎干細(xì)胞株及小鼠模型，揭示關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在PGC形成過(guò)程中的功能及調(diào)控機(jī)理。研究?jī)?nèi)容1， 使用我們現(xiàn)有的Oct4GFP及StellaGFP胚胎干細(xì)胞株, 結(jié)合其它PGC特異性分子標(biāo)記，利用無(wú)血清培養(yǎng)方式, 優(yōu)化促進(jìn)PGC形成的最佳體外條件；并以gonadal細(xì)胞共培養(yǎng)的方式建立適合PGC生長(zhǎng)的微環(huán)境。2， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立特定基因過(guò)量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞株及小鼠模型，探討關(guān)鍵基因（如激素受體及BMP家族）在小鼠PGC特化過(guò)程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。 3， 在人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)建穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)志PGC特化的報(bào)告基因體系 (Blimp1GFP和StellaGFP等)，以有效地監(jiān)測(cè)PGC的形成，并利用此體系，優(yōu)化從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化PGC的條件，探討關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)理。課題承擔(dān)單位： 華東師范大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 王 媛 特聘教授 （華東師范大學(xué)）主要學(xué)術(shù)骨干： 李大力 副研究員 （華東師范大學(xué)）周文良 教授 （中山大學(xué)）葉希韻 副教授 （華東師范大學(xué)）課題經(jīng)費(fèi)比例： 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的23%。課題4，干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育上的應(yīng)用研究目標(biāo)：建立牛ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系和體外定向誘導(dǎo)分化技術(shù)平臺(tái)，從而揭示牛多能干細(xì)胞體外分化與發(fā)育的潛能,獲得具有生物活性的配子（精子、卵子），利用這些技術(shù)加速優(yōu)良經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種群的培育。研究?jī)?nèi)容：1，參照人和動(dòng)物ES細(xì)胞建系的技術(shù)，選用不同胚齡及各種附植前牛胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，建立合適的牛ES細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。4， 以其它子課題的蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等相關(guān)研究為基礎(chǔ)，利用創(chuàng)建的牛ES細(xì)胞體系，探討牛干細(xì)胞自我更新和分化的途徑。5， 通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、選擇合適的生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子和培養(yǎng)體系誘導(dǎo)牛ES細(xì)胞分化為雄性生殖細(xì)胞，為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的改良服務(wù)。6， 以牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的精子為核供體，分析胞質(zhì)內(nèi)注射后胚胎的發(fā)育能力，建立以ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為功能性生殖細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)。課題承擔(dān)單位： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 朱 捷 教授 （中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)）主要學(xué)術(shù)骨干： 陳瑤生 教授 （中山大學(xué)）周光斌 副教授 （中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)） 于政權(quán) 副教授 （中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)）課題經(jīng)費(fèi)比例 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的23%四、年度計(jì)劃第一年：1, 建立較為理想的從小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)PGC形成的培養(yǎng)體系。2，檢測(cè)不同生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)作用,并嘗試體外誘導(dǎo)PGC減數(shù)分裂形成功能性配子。3，利用蛋白質(zhì)組學(xué)及BiFC組學(xué)研究技術(shù), 系統(tǒng)地從human ORFeome (12000 個(gè)基因) 或其他逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)庫(kù)中篩選直接與Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad相互作用的蛋白。4，分離、純化精原干細(xì)胞，利用RAR/RXR在DNA上結(jié)合區(qū)域的序列保守性，通過(guò)生物信息學(xué)，分析、檢索含有與stra8等同源的調(diào)控區(qū)的新基因，尋找已知減數(shù)分裂基因組中在精子前體細(xì)胞中表達(dá)，受視黃酸誘導(dǎo)調(diào)控的基因，為研究減數(shù)分裂調(diào)控機(jī)制檢索目標(biāo)基因。5，開(kāi)展小鼠曲細(xì)精管注射及卵母細(xì)胞胞漿注射實(shí)驗(yàn)，建立精原干細(xì)胞和精子細(xì)胞的功能檢測(cè)體系，以便于對(duì)體外誘導(dǎo)分化所得精原（精子）細(xì)胞的生物學(xué)功能加以驗(yàn)證。6，建立特定基因過(guò)量表達(dá)或缺失的轉(zhuǎn)基因及基因敲除載體。7，在人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)建穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)志PGC特化的報(bào)告基因體系。8，優(yōu)化牛ICM細(xì)胞體外維持多能性的細(xì)胞因子組合，嘗試獲取牛類(lèi)胚胎干細(xì)胞系和體外培養(yǎng)的技術(shù)平臺(tái)。預(yù)期目標(biāo)：1， 建立和完善高通量研究蛋白互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)平臺(tái)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)，BiFC組學(xué)平臺(tái), 基因組學(xué)平臺(tái)，生物信息學(xué)平臺(tái)。2， 分離獲得小鼠精原干細(xì)胞；初步完成精子前體細(xì)胞中生物信息學(xué)分析，確定23個(gè)受視黃酸誘導(dǎo)調(diào)控并參與減數(shù)分裂調(diào)控的目標(biāo)基因。3， 初步建立胚胎干細(xì)胞（或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)體系。4， 建立小鼠曲細(xì)精管注射及卵母細(xì)胞胞漿注射技術(shù)體系。5， 成功誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化成為PGC，檢測(cè)RA、BMP等5種以上信號(hào)分子對(duì)PGC分化的影響。6， 構(gòu)建小鼠配子中特異表達(dá)的Gpr126等35個(gè)重要基因的條件敲除載體或轉(zhuǎn)基因載體。7， 構(gòu)建Bli