【正文】 7， 整理論文810篇，申請專利35項。6， 比較分析兩種胚胎生成后代牛的異同，初步闡明以牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎是否具備可行性和優(yōu)越性。2，完成胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的檢測和比較；綜合前四年研究結(jié)果，闡明造成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的不同發(fā)育潛力的主要原因；綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的機(jī)制；完成對卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代的表型分析。8， 總結(jié)研究結(jié)果，匯總數(shù)據(jù)，提交研究報告，撰寫論文。6， 結(jié)合其他課題組的研究成果,利用已完善的PGC及功能性配子誘導(dǎo)體系,檢測新發(fā)現(xiàn)的重要基因(如Oct4,Nanog的相互作用分子等)的功能及分子作用機(jī)理。4， 進(jìn)一步研究體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞通過胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得的后代的表型及生理功能，評估體外誘導(dǎo)分化獲得的生殖細(xì)胞對其后代的影響。2， 通過蛋白組學(xué)，分離，純化胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞的細(xì)胞膜成分，利用蛋白雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析，深入研究細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的差別，綜合前四年研究結(jié)果分析胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞在DNA甲基化模式、基因表達(dá)和細(xì)胞表面蛋白成分的差異，闡明造成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的不同發(fā)育潛力的主要原因。第五年：1， 利用以上的研究手法，與課題4共同篩選在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞分化過程中的Nanog, Oct4，RAR/RXR的結(jié)合蛋白，檢索調(diào)控Blimp1 、Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa等基因表達(dá)的調(diào)控因子。9， 召開一次生殖學(xué)研討會。6， 初步完成重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機(jī)理研究。4， 體外誘導(dǎo)分化獲得生殖細(xì)胞，并通過卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代。2， 完成胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞的基因表達(dá)譜的檢測和比較。8， 召開國際生殖學(xué)研討會。7， 利用卵母細(xì)胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法對誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞所形成的囊胚進(jìn)行分子生物學(xué)、生理學(xué)分析及安全性檢測。5， 建立特定基因過量表達(dá)或缺失的小鼠純合體模型, 并研究上述特定基因過量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞及小鼠純合體的表型及對PGC及功能性配子形成的影響，探討關(guān)鍵基因（如激素受體）在小鼠PGC特化及減數(shù)分裂形成功能性配子過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。3， 對視黃酸在生殖細(xì)胞中的受體及輔助受體復(fù)合物的形成及其中各成分的生物學(xué)功能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制加以研究。2， 通過cDNA基因芯片篩選的方法系統(tǒng)分析胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）和精原干細(xì)胞的基因表達(dá)譜。12，撰寫論文810篇，申請專利12項。11，初步建立牛ES細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的技術(shù)體系。4，完成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）組蛋白修飾模式的檢測和比較；5，完成生物信息學(xué)分析結(jié)果確定的相關(guān)基因?qū)?xì)胞減數(shù)分裂的影響研究，初步完成相關(guān)載體、DNA文庫的構(gòu)建，篩選與視黃素受體相互作用的蛋白，確定12個參與減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的新基因；6，體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）產(chǎn)生具有精子分化表型的精原細(xì)胞，并通過小鼠曲細(xì)精管注射實驗，檢測體外誘導(dǎo)分化所得精原細(xì)胞形成克隆的能力，通過體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測其衍生細(xì)胞的受精和支持胚胎發(fā)育的能力。2，發(fā)現(xiàn)若干個新的調(diào)控干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子。12， 探索牛ES細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的能力。8， 在第一和第二課題篩選的在PGC特化和配子減數(shù)分裂過程中有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子或輔因子中，選擇幾個代表性基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因或基因敲除載體，篩選基因打靶的ES細(xì)胞株；9， 對已構(gòu)建的小鼠模型進(jìn)行表型分析，鑒定目的基因的生理功能和下游信號傳導(dǎo)途徑；10， 研究參與PGC特化的生長因子和激素等細(xì)胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控的分子機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)體系。7， 利用小鼠曲細(xì)精管注射實驗，檢測體外誘導(dǎo)分化所得精原干細(xì)胞形成克隆的能力，通過分子和細(xì)胞生物學(xué)的方法檢測其衍生細(xì)胞。利用所構(gòu)建的相關(guān)載體、DNA文庫篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。4， 用特定的抗體通過Western 雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法比較精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中與控制基因表達(dá)相關(guān)的組蛋白修飾模式的差異，如H3K4me，H3K9me等。2， 利用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)推測組蛋白各種不同修飾和基因表達(dá)之間的因果關(guān)系及組合關(guān)系，并推測組蛋白修飾相互之間形成的邏輯關(guān)系。16， 撰寫論文68篇，申請專利1項。14， 建立13個具備生殖嵌合能力的牛胚胎干細(xì)胞系。12， 獲得3個以上特定基因敲除的小鼠干細(xì)胞品系。10， 鑒定ESC分化為PGC個階段的差異表達(dá)基因，明確它們的表達(dá)模式。8， 鑒定PGC參與調(diào)節(jié)ESC特化為PGC過程中的生長因子、激素或小分子化合物。6， 獲得清除內(nèi)源精原干細(xì)胞的野生型小鼠或缺失精原干細(xì)胞的突變型小鼠，獲得精子注射小鼠后代。4， 完成對精原干細(xì)胞的基因芯片分析，確定23個受視黃酸刺激表達(dá)明顯上調(diào)的基因。2， 建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。14， 利用創(chuàng)建的牛ES細(xì)胞體系，初步探討牛ES細(xì)胞自我更新和分化途徑。12， 進(jìn)一步探索已建立的牛類胚干細(xì)胞系體外分化為三個胚層的能力及種系嵌合的研究。10， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立特定基因過量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞株或小鼠雜合體模型。8， 以gonadal細(xì)胞共培養(yǎng)的方式建立適合PGC生長及減數(shù)分裂形成功能性配子的微環(huán)境。建立穩(wěn)定的胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)平臺。設(shè)計、構(gòu)建相關(guān)載體、DNA文庫，用以篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。5， 對經(jīng)過視黃酸刺激的精原干細(xì)胞進(jìn)行基因芯片分析來研究其表達(dá)譜。3， 利用生物信息學(xué)研究手法，建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。第二年：1， 在前年度研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)完善體外胚胎干細(xì)胞（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）誘導(dǎo)分化精子細(xì)胞的有效途徑，利用已知精原干細(xì)胞的標(biāo)志基因以及帶有精子前體細(xì)胞熒光標(biāo)記蛋白的小鼠對體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞加以檢驗。9， 建立牛胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。7， 構(gòu)建Blimp1GFP和StellaGFP等PGC特化報告基因穩(wěn)定表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞。5， 成功誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞