多能干細胞定向分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(參考版)
2024-10-03 23:44本頁面
【正文】 發(fā)表論文（IF5）30～50篇，力爭在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊上（包括Cell、Nature和Science等）發(fā)表論文 3～6篇，并申報專利3～5項； 爭取以高水平完成結(jié)題驗收工作。第五年研究計劃 構(gòu)建、整合體內(nèi)外、不同分化方向和階段及不同物種的組學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建涉及蛋白、RNA和DNA的互作與轉(zhuǎn)錄表達的四維表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并解析此網(wǎng)絡(luò)在多能干細胞分化過程中的動態(tài)變化； 通過比較體內(nèi)外及不同分化方向的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的共通點和特異性，找到影響網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性和特異性的關(guān)鍵調(diào)控因子, 并研究關(guān)鍵調(diào)控因子在操控細胞命運過程中的功能和作用； 利用RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)、RNAi或小分子化合物干擾，通過操控主宰基因和非編碼RNA的表達水平，優(yōu)化多能干細胞向神經(jīng)、心血管和生殖細胞的定向分化； 研究表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在人和小鼠相應(yīng)細胞中的異同，揭示細胞分化的種屬進化差異； 完善優(yōu)化人類多能干細胞向心血管、神經(jīng)和生殖細胞高效分化的體系；運用動物疾病模型對分化細胞進行功能和安全評估。 利用蛋白coIP、RIP、RNAi及過表達，并結(jié)合分子、生化和細胞生物學(xué)等手段，驗證組學(xué)分析篩選出的特定蛋白和ncRNA，研究它們對PRC2功能、H3K27me3以及多能干細胞增殖、分化的影響。預(yù)期目標(biāo)構(gòu)建與PRC2相互作用的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（ncRNA和microRNA）；獲得若干影響多能干細胞向心血管、神經(jīng)和生殖細胞定向分化的調(diào)控因子（包括蛋白、microRNA和長鏈ncRNA）；闡明重要RNA結(jié)合蛋白和非編碼RNA在神經(jīng)和生殖分化中的作用；獲得一系列既帶有組織特異性熒光蛋白標(biāo)記，也同時表達帶標(biāo)記的PRC2組分或條件性microRNA全敲除系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，為深入研究體內(nèi)胚胎發(fā)育過程中的分子和表觀遺傳調(diào)控提供實驗平臺。第三年研究計劃 對于差異表達的microRNA、ncRNA和蛋白因子,利用RNA過表達、RNAi、反義核酸以及基因敲除、免疫共沉淀和ChIP等技術(shù)，深入研究它們在多能干細胞向心血管、神經(jīng)和生殖細胞定向分化的功能； 研究Musashi、HuD、FMRP、PELOTA、DAZL和VASA等RNA結(jié)合蛋白在多能干細胞定向分化中的功能； 利用蛋白質(zhì)復(fù)合體純化和質(zhì)譜測序系統(tǒng)高通量篩選多能干細胞定向分化中與PCR2相互作用的蛋白質(zhì),； 利用bioRIPseq高通量篩選多能干細胞定向分化中與PCR2相互作用的非編碼RNA（ncRNA）； 利用microRNA缺失干細胞及相關(guān)分化表型篩選起重要調(diào)控作用的microRNA，并研究microRNA和轉(zhuǎn)錄因子對于表觀遺傳修飾的直接調(diào)節(jié)機制。 建立體外分化的人類神經(jīng)干細胞和血管內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)體系；鑒定microRNA缺失干細胞在分化過程中的表型；構(gòu)建生物素－FLAG雙標(biāo)記PRC2的小鼠模型；建立生殖系統(tǒng)小鼠動物模型研究平臺； 優(yōu)化biotinstreptavidin介導(dǎo)的蛋白提純及質(zhì)譜鑒定，和RNA免疫沉淀及高通量測序(bioRIPseq) 的實驗方法；鑒定與PRC2相互作用染色質(zhì)區(qū)域；研究βcatenin在多能干細胞心血管組織分化過程中的結(jié)合蛋白；分析Foxg1和Jarid1B在多能干細胞分化過程中各時期的表達特性；通過RNAi和過表達研究Foxg1在神經(jīng)外胚層和前腦神經(jīng)元分化中的作用； 研究生殖質(zhì)的功能。預(yù)期目標(biāo) 建立人和小鼠多能干細胞向心血管、神經(jīng)和生殖細胞的分化、分離和培養(yǎng)系統(tǒng)； 建立若干組織特異性熒光蛋白報告體系； 獲得較為純化的心血管前體和組織細胞、神經(jīng)干細胞（NSCs）、神經(jīng)元、原始生殖細胞（PGCs）和精原干細胞（SSCs）和小鼠體內(nèi)分離的各胚層細胞； 完成RNAseq和microRNAseq測序文庫的構(gòu)建； 完成基因組敲入（knockin）質(zhì)粒載體的構(gòu)建，并得到內(nèi)源編碼bfPRC2 組分的陽性克隆ESCs；建立表達bfPRC2的分化細胞系，包括 EpiSCs (上胚層干細胞，僅對小鼠)、NPCs（神經(jīng)前體細胞）和NSCs （神經(jīng)干細胞）等。這樣實質(zhì)性的合作研究是單個研究體系、單個實驗室所難以企及的?！〗鼛啄陙恚卷椖康闹饕獏⒓尤藛T在多能干細胞的表觀遺傳機制（沈曉驊）、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（湯富酬、汪陽明），與多能干細胞的定向分化（沈沁、那潔、紀家葵、韓春生）方面做了大量扎實的工作，已經(jīng)積累了豐富的實驗經(jīng)驗和大量前期實驗結(jié)果，并獲得了多項具有國際影響的研究成果。個體發(fā)育和干細胞分化過程的本質(zhì)就是在不同類型的細胞中建立不同的表觀遺傳圖譜。盡管科學(xué)家們已投入了大量的精力去嘗試各種生長因子和細胞因子的組合培養(yǎng)體系使多能干細胞在體外特定條件下分化為各種類型的細胞，但是分化方向很難控制，分化效率低，并且所得到的細胞往往缺乏正常的生理功能。本研究進一步開發(fā)RNA 轉(zhuǎn)染技術(shù)在干細胞定向分化中的應(yīng)用，以提高分化細胞生成效率和安全性。（６）我們是世界上率先使用RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)進行細胞重編程的團隊之一，在這項新技術(shù)的應(yīng)用上已積累了很多經(jīng)驗。這一模型避免了因microRNA表達的飽和性（saturation）和冗余性（redundancy）對研究microRNA功能所造成的技術(shù)性困難。將單細胞轉(zhuǎn)錄組分析與表觀遺傳組分析結(jié)合起來，我們將突破簡單的基因表達現(xiàn)象描述以及簡單的表觀遺傳組現(xiàn)象描述，利用最新的技術(shù)手段，研究多能性細胞分化發(fā)育過程中關(guān)鍵表觀遺傳密碼對于核心基因表達網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機理。在本課題中，我們將利用我們自己最近發(fā)展的單細胞數(shù)字轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)（RNASeq），對多能干細胞在體內(nèi)、外原初分化過程中的基因表達變化進行單細胞分辨率的、全轉(zhuǎn)錄組范圍的分析，獲得基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精確定量信息。（４）單細胞分析是本項目的特色之一。利用生物素（biotin）與鏈霉親和素（streptavidin）的高度特異性及極強的親和作用，結(jié)合高通量蛋白質(zhì)及DNA測序技術(shù)，我們有一個極好的實驗平臺去揭示在全基因組范圍內(nèi)所有與PRC2相互作用的蛋白、microRNA與長鏈ncRNA分子。有的放矢地設(shè)計出提高分化效率和操控細胞命運的最佳方案。（２）本項目以發(fā)育生物學(xué)基本原理為基礎(chǔ)，不僅從宏觀系統(tǒng)水平上動態(tài)認識分化過程中的以表觀遺傳學(xué)為中心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而且從分子水平上深入研究轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳學(xué)酶機器、microRNA和長鏈
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