【正文】 項目名稱：多能干細胞定向分化的表觀遺傳學調(diào)控網(wǎng)絡首席科學家：沈曉驊 清華大學起止年限：依托部門：教育部一、關鍵科學問題及研究內(nèi)容１、擬解決的關鍵科學問題干細胞分化和個體發(fā)育伴隨著表觀遺傳狀態(tài)、染色質(zhì)結構和基因表達的改變。多能干細胞（包括ESCs和iPSCs）代表哺乳動物細胞的一種最初狀態(tài) (ground state)，被看作是了解分化過程的起點和關鍵。因此，對多能干細胞定向分化和其中的分子及表觀遺傳學調(diào)控的研究是生命科學和再生醫(yī)學領域的核心。本項目要探索的最終科學問題是：表觀遺傳機理如何控制多能干細胞的定向分化？表觀遺傳機制逐步限制細胞分化和發(fā)育的潛能。多能性干細胞在分化過程中必須經(jīng)歷一系列表觀遺傳狀態(tài)的改變和中間狀態(tài)直至譜系確立。在此過程中，表觀遺傳圖譜是如何建立的？換而言之，組織特異性的信號因子、轉錄因子和RNA分子是如何作用于表觀遺傳酶機器，引導其建立細胞類型特異性的表觀遺傳修飾圖譜？一旦圖譜建立，細胞特有的表觀遺傳修飾圖譜是如何解讀的？即細胞特有的表觀遺傳修飾圖譜是如何決定基因表達和細胞譜系命運的？多能性干細胞受內(nèi)、外信號的影響而選擇不同命運。那么，多能干細胞在分化成不同組織類型的細胞過程中，表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡有何異同？另外，細胞培養(yǎng)并不能完全反映個體發(fā)育的規(guī)律。那么，同組織類型的細胞在體外分化和體內(nèi)個體發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡有何異同？雖然小鼠是研究干細胞分化和哺乳動物發(fā)育極佳的模式動物，但是干細胞在再生醫(yī)學中的應用需要對人類的組織細胞分化有很好的認識。那么，從進化角度來看，表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡在人和小鼠等物種間有何異同性？如何指導人類多能干細胞在體外高效定向分化為近似于體內(nèi)發(fā)育的各種功能細胞，并促進它們的功能成熟及提高修復損傷器官的能力？尋找這些關鍵科學問題的答案，將加深對干細胞定向分化和生命個體發(fā)育調(diào)控規(guī)律的認識，為建立能應用于再生醫(yī)學的定向分化技術體系奠定基礎。２、主要研究內(nèi)容圍繞以上科學問題，我們以表觀遺傳學調(diào)控為中心，綜合運用遺傳學、分子生物學、生物化學、蛋白組學及基因組學等系統(tǒng)生物學技術，對體外和體內(nèi)干細胞分化過程展開系統(tǒng)、深入的分析。首先，以多能干細胞向包括神經(jīng)外胚層、心血管中胚層等體細胞和生殖細胞的分化為模型，在已建立的分化體系的基礎上，利用報告基因分離出高純度的各分化組織細胞系。在以上不同的分化過程中，構建以表觀遺傳因子為中心的分子調(diào)控網(wǎng)絡，解析單細胞及多細胞的全基因組表達譜和表觀遺傳修飾譜，研究信號通路、轉錄因子、非編碼RNA和表觀遺傳因子之間的相互作用，以及這些互作對基因表達和細胞命運的影響。這些以表觀遺傳因子為中心的蛋白RNADNA相互關聯(lián)的機制及其對全基因組轉錄譜的影響作用，我們通稱之為表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡。我們將不僅從宏觀系統(tǒng)水平上認識分化過程中的表觀遺傳學、轉錄和轉錄后調(diào)控，而且從分子水平上深入研究幾個關鍵轉錄因子、表觀遺傳學酶機器、microRNA和長鏈ncRNA對以上分化過程的影響。通過對不同分化系統(tǒng)的比較，了解不同組織器官的細胞譜系是如何被確立的，尋找影響定向分化的共通的和特異的調(diào)控機制。利用報告基因、基因敲入和敲除的小鼠模型，研究表觀遺傳調(diào)控在體內(nèi)組織發(fā)育中的作用。通過從分化組織細胞類型、動物體內(nèi)外和物種進化三個維度上比較表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡的異同，鑒定出影響多能干細胞定向分化的關鍵調(diào)控機制和調(diào)控分子。最后研究如何操控以上關鍵調(diào)控因素，獲得高效、安全地誘導多能干細胞分化為神經(jīng)、心血管和生殖細胞的新手段，為實際應用奠定基礎。二、預期目標１、總體目標本項目將建立一支高學術水平的研究團隊，充分利用人和小鼠在體內(nèi)和體外研究系統(tǒng)的優(yōu)勢和互補性，重點研究多能干細胞向三種不同模式細胞分化的以表觀遺傳調(diào)控為中心的分子機制。在多細胞或單細胞水平上，解析多能干細胞向三種不同模式細胞分化的、細胞特有的調(diào)控因子與表觀遺傳因子間相互作用的圖譜，解析全基因組表達譜和表觀遺傳修飾譜，構建以調(diào)控因子與表觀遺傳因子的互作為中心的、關聯(lián)表觀遺傳修飾和基因表達的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡，找到控制不同分化方向的調(diào)控網(wǎng)絡的共通點和特異性，全面系統(tǒng)地認識表觀遺傳調(diào)控對多能干細胞在體內(nèi)、外及不同譜系分化、發(fā)育中的作用。篩選調(diào)控上述分化過程的關鍵調(diào)控因子（包括表觀遺傳因子、非編碼RNA、轉錄因子和信號分子）；通過綜合調(diào)控若干關鍵因子來優(yōu)化各分化體系，為人工操控干細胞命運，建立高效、安全的定向分化手段提供線索，為干細胞療法的臨床實現(xiàn)提供理論和應用基礎。在相關領域取得一些理論、方法和技術突破，力爭取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果；培養(yǎng)高水平研究人才，形成能夠持續(xù)進行創(chuàng)新性研究的能力；提升我國干細胞基礎研究水平和國際影響力，促進我國干細胞和發(fā)育生物學學科的發(fā)展。２、五年具體目標 （１）建立人和小鼠多能干細胞 (ESCs / iPSCs)　向神經(jīng)外胚層、心血管中胚層和生殖細胞的分化和純化體系。（２）構建若干基因敲入（knockin) 和報告基因的小鼠模型，為研究在動物體內(nèi)表觀遺傳機制對胚胎發(fā)育、器官形成的調(diào)控提供實驗平臺。（３）繪制并比較體內(nèi)外各模式細胞的全基因組表達圖譜（包括蛋白編碼基因、microRNA和長鏈ncRNA）和表觀遺傳修飾圖譜。（４）建立關聯(lián)蛋白、DNA和RNA 的三維調(diào)控網(wǎng)絡，并解析細胞特異的調(diào)控因子（包括蛋白、長鏈ncRNA和microRNA）與表觀遺傳機制的相互作用。（５）構建、整合及比較不同分化方向及狀態(tài)的細胞的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡，全面、動態(tài)地認識細胞命運決定和細胞譜系的特異性與穩(wěn)定性維護的分子機制。（６）找到影響干細胞分化和命運決定的若干關鍵調(diào)控因子（蛋白、microRNA或長鏈ncRNA)；實現(xiàn)向多巴胺能神經(jīng)元、脊髓運動神經(jīng)元、心肌、血管等組織和生殖細胞的高效定向分化。 （７）預期在國際主流期刊上（影響因子IF5）發(fā)表論文30～50篇，力爭在國際頂尖學術期刊上（包括Cell、Nature和Science等）發(fā)表論文 3～6篇。（８）建立和培養(yǎng)一支具有國際影響力的高水平的干細胞研究梯隊，爭取培養(yǎng)國家杰出青年基金獲得者3～5名，并申報專利3～5項。三、研究方案１、總體學術思路本項目將以人和小鼠多能干細胞及小鼠體內(nèi)干細胞為模型，來探討生物發(fā)育和細胞分化的內(nèi)在規(guī)律，并利用這些規(guī)律建立高效、安全的干細胞定向分化體系（如圖