基因工程6重組體克隆的篩選與鑒定-資料下載頁
2025-01-20 15:04本頁面
【正文】 總 mRNA的 1‰ ），它與阻斷轉(zhuǎn)譯雜交的原理相似。 其主要程序是：首先將克隆 DNA結(jié)合到硝酸纖維素濾膜上，再與未經(jīng)分離純化的 mRNA或細胞的總 RNA雜交；然后漂洗濾膜，在低鹽緩沖液或甲酰胺的緩沖液中加熱，把雜交的mRNA洗脫下來（即把 mRNA釋放出來）；再用回收的 mRNA進行體外轉(zhuǎn)譯試驗，用聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影分析鑒定轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物，同時亦可測定蛋白產(chǎn)物的生物活性，以達到篩選所需基因的目的。 物理篩選法 凝膠電泳篩選法 帶有插入片段的重組體在分子量上會有所增加，因而一種直截了當?shù)姆椒ㄊ欠蛛x質(zhì)粒的DNA并測定其分子長度。對此，電子顯微鏡是有效的方法，但過于繁瑣，通常用操作程序比較簡單的凝膠電泳法進行檢測。由于質(zhì)粒DNA的電泳遷移率是與其分子量大小成比例的，根據(jù)在凝膠中遷移速度的差別，即可鑒定出含有外源 DNA插入序列的重組體菌落。 有些假陽性轉(zhuǎn)化菌落（如自我連接載體、缺失連接載體、未消化載體、兩個互相連接的載體，以及兩個外源片段插入的載體等轉(zhuǎn)化的菌落），用平板法篩選是無法鑒別的，但可以被電泳法淘汰。因為由這些轉(zhuǎn)化菌落分離的質(zhì)粒 DNA分子的大小各不相同：和真正的陽性重組體 DNA比較，前三種重組 DNA分子較小，在電泳時的泳動率較快，其 DNA帶的位置跑在陽性重組 DNA帶的前面；后兩種重組 DNA分子較大，泳動率較慢，其 DNA帶的位置跑在陽性重組 DNA帶的后面。所以電泳法能篩選出有插入片段的陽性重組體。 如果插入片段是大小相近的非目的基因片段，對于這樣的假陽性重組體，電泳法仍不能鑒別，只有進一步用 Southern blot雜交，即以目的基因片段制備的放射性探針和電泳篩選出的重組體 DNA雜交，才能最終確定真陽性重組體。 Southern blot： 由 E. southern于 1975年創(chuàng)立的雜交方法：將瓊脂糖凝膠上的 DNA 片段按照原有順序轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上并固定起來，然后與 P32標記的 DNA或 RNA探針雜交，用放射自顯影確定雜交帶。Northern blot: 類似于 Southern blot的 RNA分子雜交技術 , 與 Southern blot的主要區(qū)別是在變性劑的存在下，將瓊脂糖凝膠上的 RNA 片段按照原有順序轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，然后與 P32標記的 RNA探針雜交，用放射自顯影確定雜交帶。Western blot: 是轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維薄膜上，以親和反應或免疫反應或結(jié)合反應測定蛋白質(zhì)的技術。蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠進行電泳并染色。 R環(huán)檢測法 R環(huán) 指的是 RNA通過取代與其序列一致的 DNA鏈而與雙鏈 DNA雜交，被取代的DNA單鏈與 RNADNA雜交雙鏈所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（被取代的原 DNA鏈在雜交區(qū)呈突出的環(huán)狀） 。 R環(huán)的形成是因為：在 70%甲酰胺溶液中，當接近 DNA變性溫度時，雜交雙鏈 DNARNA分子比雙鏈 DNADNA分子更穩(wěn)定。因此，仔細控制形成 R環(huán)的條件，將 RNA及 DNA相互混合， RNA便會同它的雙鏈 DNA分子中的互補序列退火形成穩(wěn)定的 DNARNA雜交分子，而使被取代的另一鏈處于單鏈狀態(tài)。 R環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成就十分穩(wěn)定，而且可以在電子顯微鏡下觀察到。所以應用 R環(huán)檢測法，可以鑒定出雙鏈 DNA中存在的與特定 RNA分子同源的區(qū)域。 根據(jù)這樣的原理，在有利于形成 R環(huán)的條件下，使待檢測的純化的質(zhì)粒 DNA，在含有mRNA分子的緩沖液中進行局部地變性。如果質(zhì)粒 DNA分子上存在著與 mRNA探針互補的序列，那么這種 mRNA就將取代 DNA分子中的相應的互補鏈，形成 R環(huán)結(jié)構(gòu)。然后在電子顯微鏡下觀察，便可以檢測出重組體質(zhì)粒的 DNA分子。演講完畢，謝謝觀看
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