第四章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定-資料下載頁(yè)
2025-06-24 02:55本頁(yè)面
【正文】 夠催化生物發(fā)光反應(yīng)。 3. 依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法（1）快速裂解菌落鑒定分子大小 ——根據(jù)有外源DNA片段插入的重組質(zhì)粒與載體DNA之間大小的差異來(lái)區(qū)分重組子和非重組子 （2）限制性核酸內(nèi)切酶酶解分析法——不僅可以進(jìn)一步篩選鑒定重組子，而且能判斷外源DNA片段的插人方向及分子質(zhì)量大小等 將重組DNA分子限制酶切點(diǎn)圖譜與空載體圖譜作對(duì)比，根據(jù)各種酶切所得DNA片段的大小及變化，即可推測(cè)有無(wú)外源DNA的插入，并確定出各插入片段的相對(duì)位置。 （3）利用PCR方法篩選確定重組子利用合適的引物，以從初選出來(lái)的陽(yáng)性克隆中提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析來(lái)確定目的基因是否重組入載體中。（4）DNA序列測(cè)定 最后為了確證目的基因序列的正確性，必須對(duì)重組體的DNA進(jìn)行序列測(cè)定。4. 物理檢測(cè)法（1）凝膠電泳檢測(cè)法 質(zhì)粒DNA的電泳遷移率是與其分子量大小成比例的。因此，那些帶有外源DNA插入序列的分子量較大的重組體DNA，在凝膠中的遷移速度，就要比不具有外源DNA插入序列的分子量較小的質(zhì)粒DNA來(lái)得緩慢些根據(jù)這種差別，就可以容易地鑒定出哪些菌落是含有具外源NDA插入序列的分子量較大的重組質(zhì)粒。（2）R環(huán)檢測(cè)法 在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度（70%）的甲酰胺溶液中，即所謂的形成R環(huán)的條件下，雙鏈的DNARNA分子要比雙鏈的DNADNA分子更為穩(wěn)定。因此，將RNA及DNA的混合物置于這種退火條件下，RNA便會(huì)同它的雙鏈DNA分子中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的DNARNA雜交分子，而使被取代的另一鏈處于單鏈狀態(tài)。這種由單鏈DNA分支和雙鏈DNARNA分支形成的“泡狀”體，叫做R環(huán)結(jié)構(gòu)。R環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成就十分穩(wěn)定，而且可以在電子顯微銳下觀察到。所以，應(yīng)用R環(huán)檢測(cè)法，可以鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域。（2） 目的克隆的鑒定經(jīng)過(guò)初步篩選獲得的陽(yáng)性克隆，下一步必須對(duì)帶有目的序列的克隆做進(jìn)一步篩選和鑒定。鑒定一般有幾種常用方法：（1）分子雜交；（2）免疫學(xué)檢測(cè)；（3）DNA測(cè)序；（4）蛋白質(zhì)活性篩選；（5）基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。1. 分子雜交核酸分子雜交有多種方法：原位雜交、點(diǎn)雜交及Southern雜交等。原理：帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。如果彼此退火的核酸來(lái)自不同的生物有機(jī)體，那么如此形成的雙鏈分子就叫做雜種核酸分子。能夠雜交形成雜種分子的不同來(lái)源的DNA分子其親緣關(guān)系較為密切；反之，其親緣關(guān)系則比較疏遠(yuǎn)。因此DNA／DNA的雜交作用，可以用來(lái)檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間是否存在著親緣關(guān)系，而形成DNA／DNA或DNA／RNA雜種分子的這種能力，可以用來(lái)揭示核酸片段中某一特定基因的位置。核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)不同的步驟：?第一，將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過(guò)程特稱為核酸印跡轉(zhuǎn)移，主要的有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和噬菌班印跡法；?第二，是將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時(shí)也稱這類(lèi)核酸雜交為印跡雜交。2. 免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)的前體是需要有目的蛋白質(zhì)，一般從純化的蛋白質(zhì)制備抗體。原理：是細(xì)胞因子（或受體）與相應(yīng)的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體）結(jié)合，通過(guò)同位素、熒光或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細(xì)胞因子（或受體）的水平。這類(lèi)方法的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期短，少受抑制物或相似生物池功能因子的干擾，如抗體的特異性高可區(qū)分不同型或亞型的細(xì)胞因子（如ifn），一次能檢測(cè)大量標(biāo)本，易標(biāo)準(zhǔn)化。與生物學(xué)活性檢測(cè)方法相比，免疫學(xué)檢測(cè)法在許多情況下敏感性低于前者，所得結(jié)果不表示生物學(xué)活性，有的mcab只能識(shí)別重組的細(xì)胞因子，在檢測(cè)天然的細(xì)胞因 子中受到限制。如：ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( EnzymeLinked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái)，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。原理 ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。操作步驟：（1）克隆載體表達(dá)的蛋白與固相支持物結(jié)合；（2）加入目的蛋白特異的第一抗體，洗去未結(jié)合的抗體；（3）加入二抗，二抗分子偶連有標(biāo)記酶；（4）加入無(wú)色底物；（5）對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行觀察。3. 蛋白質(zhì)活性和功能互補(bǔ)篩選DNA雜交和免疫檢測(cè)對(duì)于多數(shù)基因和基因產(chǎn)物都是有效的。蛋白質(zhì)活性作為克隆的指示標(biāo)記有一定的難度。如果篩選的目的蛋白是一種酶，也可以根據(jù)酶對(duì)底物的反應(yīng)來(lái)設(shè)計(jì)克隆的檢測(cè)。功能互補(bǔ)法：該方法要求被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是某一特定基因的缺陷株，攜帶來(lái)自野生型基因DNA的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中能與缺陷基因互補(bǔ)，最終選擇具有正常功能的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。10 / 1
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1