第四章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 100ms；③工作溫度：對(duì)不同類型細(xì)胞所要求的條件不同，可以在0℃至室溫（25℃）之間進(jìn)行選擇； ④ DNA的構(gòu)象和濃度：線性 DNA比環(huán)狀 DNA要好，濃度控制在1～ 40 μg／mL。4. 磷酸鈣或DEAE一葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染這是將外源基因?qū)氩溉轭惣?xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的常規(guī)方法。經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜融合，細(xì)菌內(nèi)容物轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。這種方法具有多方面的優(yōu)點(diǎn)，包括可保護(hù)DNA在導(dǎo)入細(xì)胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)，適用的植物種類廣泛，重復(fù)性高，包裝在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可穩(wěn)定地貯藏等。在顯微注射的實(shí)際操作中，受體細(xì)胞或組織是被固定在褐藻酸鈉或瓊脂糖等特定載體上，然后通過(guò)顯微操作器，將轉(zhuǎn)化的外源DNA直接注射到受體細(xì)胞核中去。將DNA包被在金或鎢的微粒中，然后用基因槍將DNA包被的顆粒直接轉(zhuǎn)移到原位組織、細(xì)胞乃至細(xì)胞器中去。這一步的實(shí)質(zhì)就是將兩種DNA在體外進(jìn)行酶促連接，最終獲得一個(gè)重組子。 粘末端連接 1. 全同源粘性末端連接 如果目的序列與載體兩端具有相同的限制內(nèi)切酶位點(diǎn)，則同一限制性核酸內(nèi)切酶酶切后在目的基因與載體兩端產(chǎn)生完全相同的粘性末端，在降低溫度退火時(shí)，能重新互補(bǔ)結(jié)合，在DNA連接酶催化下，目的序列與載體DNA連接，實(shí)現(xiàn)基因重組，稱為全同源粘性末端連接。雙向插入盡管對(duì)基因克隆無(wú)影響，卻會(huì)影響基因的表達(dá)。定向克隆也可以通過(guò)在一端造成平端，另一端產(chǎn)生同源粘性末端實(shí)現(xiàn)年平連接。如果目的序列和載體上沒(méi)有相同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可供使用，用不同的限制性內(nèi)切酶切割后的粘性末端不能互補(bǔ)結(jié)合，則可用適當(dāng)?shù)拿笇⒄承阅┒俗優(yōu)槠侥┒?，再用T4DNA連接酶。需采用高濃度的DNAA和連接酶，同時(shí)，在連接體系中加入低濃度的聚義二醇類物質(zhì)，也可有效提高連接效率。外源DNA片段和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸。1. DNA連接子法：DNA連接子是一段人工合成的具有平頭末端的雙鏈寡聚脫氧核苷酸片斷，長(zhǎng)度一般為8~12個(gè)，其上有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。如靶DNA內(nèi)部含有與連接子相同的識(shí)別序列時(shí)，在進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶切割之前，必須進(jìn)行甲基化，以保護(hù)靶DNA不被破壞。（4） TA克隆 目前TA克隆是用來(lái)直接克隆PCR產(chǎn)物的方便方法。如何從克隆的群體中排除假陽(yáng)性的重組子，如何從成千萬(wàn)的重組子中篩選出所需要的目的克隆，如何證明選擇的克隆含有所需要的目的基因？所以篩選是克隆目的基因的重要步驟。從初步篩選直到分子雜交，進(jìn)一步到DNA測(cè)序和基于蛋白質(zhì)功能的分析，使得對(duì)克隆的檢測(cè)逐步深入、精確。重組子的篩選含有兩層含義：（1）把攜帶有外源插入DNA片段的克隆挑選出來(lái)；（2）把攜帶有特定外源插入片段的重組子挑選出來(lái)。在質(zhì)粒載體中通常使用雙抗藥性標(biāo)記。（2） 插入失活篩選法檢測(cè)克隆載體攜帶有外源DNA的通常方法是插入失活。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞分別培養(yǎng)在含氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中，便可檢出轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。（4） 環(huán)絲氨酸篩選這種篩選方法只使用于抗四環(huán)素的基因插入失活的重組克隆篩選。對(duì)菌落或噬菌斑平板進(jìn)行影印復(fù)制，通過(guò)兩個(gè)平板的比較，才能辨別插入失活的表型特征?；蛞欢涡蛄校幋aβ半乳糖苷酶的α肽，而宿主細(xì)胞為lac z△M15的突變株。利用β半乳糖苷酶顯色反應(yīng)即可挑選出含有外源DNA重組體的陽(yáng)性克隆2. 報(bào)告基因報(bào)告基因是某種生物的特定基因，裝配在載體上成為載體結(jié)構(gòu)的一部分，具有指示的功能。細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因產(chǎn)物常作為直接觀察載體活動(dòng)的指示分子?；蚬こ讨谐Ｓ玫膱?bào)告基因：如：（1）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloraphenicol acetyltransferase，CAT）基因——氯霉素可選擇性地與原核細(xì)胞核糖體50S亞基結(jié)合，抑制肽酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而阻斷肽鍵的形成并最終抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。 （3）利用PCR方法篩選確定重組子利用合適的引物，以從初選出來(lái)的陽(yáng)性克隆中提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析來(lái)確定目的基因是否重組入載體中。（2）R環(huán)檢測(cè)法 在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度（70%）的甲酰胺溶液中，即所謂的形成R環(huán)的條件下，雙鏈的DNARNA分子要比雙鏈的DNADNA分子更為穩(wěn)定。所以，應(yīng)用R環(huán)檢測(cè)法，可以鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域。原理：帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)不同的步驟：?第一，將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過(guò)程特稱為核酸印跡轉(zhuǎn)移，主要的有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和噬菌班印跡法；?第二，是將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。這類方法的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期短，少受抑制物或相似生物池功能因子的干擾，如抗體的特異性高可區(qū)分不同型或亞型的細(xì)胞因子（如ifn），一次能檢測(cè)大量標(biāo)本，易標(biāo)準(zhǔn)化。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái)，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。3. 蛋白質(zhì)活性和功能互補(bǔ)篩選DNA雜交和免疫檢測(cè)對(duì)于多數(shù)基因和基因產(chǎn)物都是有效的。10 / 10
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