第四章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定(編輯修改稿)
2025-07-21 02:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 法的優(yōu)缺點為：優(yōu)點：該方法是最方便的克隆方法，其連接效率高，一般采用低濃度酶在低于16度，高濃度ATP的情況下進行連接。缺點：容易出現(xiàn)載體自身環(huán)化、雙向插入（即目的基因以兩種方向插入載體和多拷貝插入的現(xiàn)象，從而在轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)高背景，使得篩選更為困難。雙向插入盡管對基因克隆無影響，卻會影響基因的表達。采用堿性磷酸酶事先對載體DNA進行去磷酸化處理，可有效避免載體自身環(huán)化現(xiàn)象；建立連接體系時，若將目的基因和載體DNA的摩爾數(shù)控制在2~3：1，則可有效減少多拷貝插入的問題。2. 定向克隆使目的基因按一定的方向插入載體的克隆方案稱為定向克隆。最常用的定向克隆方案使用兩種限制性內(nèi)切酶切割載體和目的基因，從而在載體和目的基因兩端產(chǎn)生非同源互補的兩個粘性末端。定向克隆也可以通過在一端造成平端，另一端產(chǎn)生同源粘性末端實現(xiàn)年平連接。定向克隆有效的限制了自身環(huán)化，并且實現(xiàn)了目的基因的定向插入，在基因克隆，尤其是表達某一基因時，極為有用。定向克隆的連接體系與相應的粘性末端或平末端連接相同。（1） 平末端連接 T4DNA連接酶能催化限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的 DNA平末端進行連接。如果目的序列和載體上沒有相同的限制性內(nèi)切酶位點可供使用，用不同的限制性內(nèi)切酶切割后的粘性末端不能互補結(jié)合，則可用適當?shù)拿笇⒄承阅┒俗優(yōu)槠侥┒耍儆肨4DNA連接酶。 平端連接比粘性末端連接效率低很多，但具有普適性，可適用于任何DNA片斷間的連接，是非常有用的基因克隆策略。另外，平端連接還常用于將人工合成的人工接頭連接到DNA末端，為進一步的克隆奠定基礎。 平端連接的主要缺點是連接效率低和存在多拷貝的插入，為此，在平端連接時。需采用高濃度的DNAA和連接酶，同時，在連接體系中加入低濃度的聚義二醇類物質(zhì)，也可有效提高連接效率。多拷貝插入的缺點?？赏ㄟ^控制插入片斷與載體的墨爾比解決。（2） 同聚物加尾同聚物加尾法就是利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在載體分子及外源雙鏈DNA片段的3’末端各加上一段寡聚核苷酸，人工制成粘性末端。外源DNA片段和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸。這種方法的核心是利用末端轉(zhuǎn)移酶的功能，它能夠催化脫氧核苷三磷酸逐個地加到DNA分子的3OH末端，反應中不需要模板的存在，4種dNTP中的任何一種都可以作為它的前體物。因此，當反應混合物中有一種dNTP時，就可以將核苷酸轉(zhuǎn)移到雙鏈DNA分子的突出或隱蔽的3OH上，行程僅由一種核苷酸組成的尾巴。（3） 人工接頭連接法人工接頭連接法可分為兩種：一種為DNA連接法（linker）,另一種是DNA 接頭法(adapter)。1. DNA連接子法：DNA連接子是一段人工合成的具有平頭末端的雙鏈寡聚脫氧核苷酸片斷，長度一般為8~12個，其上有一個或數(shù)個限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點。由此可以看出，DNA連接子的作用主要是在DNA末端天加一個限制性內(nèi)切酶識別位點，已產(chǎn)生粘性末端，已利用DNA片斷連接。主要使用于對平末段的改造和連接。2. DNA 接頭法: 盡管DNA人工連接子技術(shù)具有許多優(yōu)越性，但也存在一些弊端。如靶DNA內(nèi)部含有與連接子相同的識別序列時，在進行限制性核酸內(nèi)切酶切割之前，必須進行甲基化，以保護靶DNA不被破壞。這一系列步驟，使得DNA連接子技術(shù)操作較為煩瑣。DNA接頭是一段人工合成的一端或兩端為粘性末端的DNA序列，其中包含一個至多個限制性核酸內(nèi)切酶位點。接頭法克服了連接子僅適用于平端改造的缺點，可以平端與目的基因連接，也可以粘性末端與目的基因連接。（4） TA克隆 目前TA克隆是用來直接克隆PCR產(chǎn)物的方便方法。其原理是：由于TaqDNA聚合酶在擴增目的基因的同時，可以不依賴于模板而在產(chǎn)生的兩端加上兩個游離的“A”，因而只要載體切口處人工加上游離的“T”，PCR產(chǎn)物即可與載體連接。TA克隆載體已被廣泛應用，并已成為商品化載體。 第三節(jié) 克隆的篩選與檢測在基因克隆、DNA文庫制備過程中，外源DNA與載體連接、載體轉(zhuǎn)化宿主細胞或體外包裝的載體中，往往有一部分是沒有外源DNA的，來自自我載體的空荷載體。如何從克隆的群體中排除假陽性的重組子，如何從成千萬的重組子中篩選出所需要的目的克隆，如何證明選擇的克隆含有所需要的目的基因？所以篩選是克隆目的基因的重要步驟。篩選的目的就是挑選出含有目的序列的重組體。（一） 重組克隆的初步篩選克隆的篩選可以根據(jù)載體類型、受體細胞特性的變化、外源DNA分子本身的特性，采用不同的方法。主要有遺傳學檢測、物理特性檢測、分子雜交以及免疫學分析等。從初步篩選直到分子雜交，進一步到DNA測序和基于蛋白質(zhì)功能的分析，使得對克隆的檢測逐步深入、精確。1. 重組克隆的遺傳學檢測遺傳學檢測方法是重組子篩選過程中最初的檢測步驟。重組子的表征來源于載體所攜帶的標記和重組子結(jié)構(gòu)特性。根據(jù)這兩類表征對重組子進行初步篩選。重組子的篩選含有兩層含義：（1）把攜帶有外源插入DNA片段的克隆挑選出來；（2）把攜帶有特定外源插入片段的重組子挑選出來。(1) 抗藥性篩選這是利用載體DNA上組裝的抗藥性選擇標記進行篩選的方法。常用的抗生素篩選劑:氨芐青霉素（ampicillin，Ap或Amp）；氯霉素（chloramphenico
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