6基因的重組與轉移(編輯修改稿)
2025-02-06 01:14 本頁面
【文章內容簡介】 的水重懸 分裝成 50300?L 電轉儀調為,25?F 脈沖控制器200400? ?g質粒DNA On ice混合 加入1mLSOC培養(yǎng)液 37176。C中速震蕩 60分鐘 10100?L轉化液涂含抗菌素的平板 轉化 （ 2）電轉化法 4. 平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌 10100?L轉化液 涂于含抗菌素的平板 37℃ 過夜 環(huán)形重組質粒 質粒自我連接 線性載體或 DNA片斷進入細菌會被降解。 ① 環(huán)形質粒數(shù) （ 1）重組質粒 5. 影響轉化率的因素 ①生長狀態(tài) 制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。 ②必須在冰冷的條件下制備。 要充分，使細菌細胞膜失去一些蛋白。 ④儲存感受態(tài)菌要在 70℃ 以下 ③ CaCl2處理 ⑤使用感受態(tài)菌時必須迅速融化 融化后一般不能再次凍存使用。 （ 2）感受態(tài)細胞 （ petent cells) 把重組的噬菌體 ?DNA或 Cosmid質粒 DNA包裝成具有感染能力的 ?噬菌體顆粒。 6. 體外包裝的噬菌體的轉導 （ 1）體外包裝（ in vitro packaging） （ 2）轉導（ transduction） 通過受體菌細胞表面的 ?DNA接受器位點（ receptor site)，使帶有外源基因的重組體 DNA注入受體大腸桿菌進行擴增。 cI857基因是個溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細菌后， 在 32℃ 下培養(yǎng)細菌時能夠保持溶源性。 但當溫度升高到 44℃ —45℃ 時，就會導致cI基因編碼的阻遏蛋白失活， ?DNA復制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。 （ 3） cI857基因突變的 ?噬菌體 但由于該噬菌體的 S基因上有一個突變，所以細菌還不裂解。 cI857 其它基因 溶源狀態(tài)（ ?DNA不轉錄、不翻譯） ?DNA 阻遏 蛋白 阻遏 蛋白 44℃ —45℃ ?DNA轉錄、翻譯合成外殼蛋白 32℃ ?噬菌體 1 外殼蛋白基因 E發(fā)生了無義突變， 不能合成頭部蛋白 ，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。 在 cI857基因突變的 ?噬菌體的基礎上，選擇兩種外殼蛋白的突變型 ?噬菌體。 （ 4） 互補型噬菌體 外殼蛋白基因 D發(fā)生了無義突變， 不能合成頭部的包裝識別蛋白 ，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。 ?噬菌體 2 (5) 體外包裝過程 體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每 ?g ?DNA能形成 106噬菌斑）。 （ 6） 轉導 轉化率高的菌株； 有突變的菌株（與導入的載體基因互補）； 不育的菌株（不會與其他酵母接合）。 第三節(jié) 外源基因導入真核細胞 一、導入酵母細胞 1. 菌株選擇 如： ura352, trp1289, leu23, leu2112, his3? 1 （ 1）利用原生質球進行轉化 2. 酵母的轉化方法 酵母 原生質體 感受態(tài) 酶去壁 CaCl PEG 插入外源基因 的酵母載體 PEG（聚乙二醇）使 細胞壁 具有通透性，允許 DNA進入。 CaCl2使 細胞膜 具有通透性，允許 DNA進入。 轉化 酵母 插入外源基因的酵母載體 感受態(tài) 40% PEG 4000 （ 2）利用 Li+鹽進行轉化 葉盤 消毒 切取 土壤農(nóng)桿菌浸泡 看護培養(yǎng)基 愈傷組織 分化幼苗 二、導入植物細胞 1. 葉盤法（ leaf disk) 植物細胞 原生質體 纖維素酶和果膠酶 DNA 混合入電擊緩沖液 12kV,325?F電擊 愈傷組織 幼苗 分化 2. 電擊法（ electroporation) 又稱 高速微型子彈射擊法（ Highvelocity microprojectiles) DNA ?m鎢彈頭 吸附 特制手槍 射擊植物 裝入 （ gene gun） 4. 膿桿菌（ agrobacterium）介導 ? 農(nóng)桿菌 : used extensively for geic engineering of plants. ? 包含 Ti質粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) ? TDNA (TransferredDNA), 可以轉移進入植物基因組 . Tumor induced by A. tumefaciens 農(nóng) 桿菌（ agrobacterium） A、 Ti 質粒介導的整合轉化程序 幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會形成根瘤，這是由于植物根部被一種革蘭氏陰性土壤桿菌農(nóng)桿 根瘤菌（ ） 感染所致，其致瘤特性是由該菌細胞內的 野生型質粒 Ti（Tumorinducing） 介導的。 （ 1） Ti 質粒的結構與功能 Ti Plasmid TDNA region Le
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