基因的體外重組和轉(zhuǎn)化(編輯修改稿)
2025-02-24 19:19 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 3’端人為地各加一個 T利用 Taq DNA聚合酶，當(dāng)原料中只有 dTTP時，被迫在平端載體上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TA TA四、 DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)1. 插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。EcoRI EcoRI EcoRI（ 1）用相同的酶切（ 2）用同尾酶切BamHI、 BclI、 BglII、 Sau3AI、 XhoII都產(chǎn)生 GATC4個堿基的粘性末端。2. DNA插入的方向正確（ 1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRI BamHIEcoRI BamHIEcoRI BamHI3. 插入基因的開放閱讀框（ ORF）正確（ 1） DNA定向插入（ 2）起始密碼尤其當(dāng) 載體上有 ATG起始密碼的時候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRI EcoRIATGGAATTC T重組 但移碼突變！4. 防止載體自身環(huán)化連接（ 1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多 10倍以上。（ 2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的 5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’ 3’ 載體插入片斷五、載體和外源 DNA插入片段的連接結(jié)果1. 載體自身環(huán)化連接2. 載體之間互相連接3. 插入片段互相連接4. 一個載體與幾個插入片段重組五、載體和外源 DNA插入片段的連接結(jié)果5. 幾個載體與一個插入片段重組7（能存活）（能存活）（不能存活）（能存活）（能存活） 1972年，美國斯坦福大學(xué)的 伯格 （ ）等人于把一種猿猴 病毒 的 DNA與 λ噬菌體 DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用 DNA連接酶把這兩種 DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組 DNA分子。 1973年， 科恩 （ ）等人把一段外源 DNA片段與 質(zhì)粒 DNA連接起來，構(gòu)成了一個重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 大腸桿菌 ，第一次完整地建立起了基因克隆體系。 n 美國總統(tǒng)國家科學(xué)獎 中國科學(xué)院愛因斯坦講席教授、美國國家科學(xué)院院士、美國斯坦福大學(xué)教授斯坦利 ?科恩 (Stanley N. Cohen) n Stanley Cohen教授發(fā)明該專利時的筆記照片 重組 DNA專利 從批準(zhǔn)該專利到該專利 1997年 12月 2日失效的 17年中，該專利一共許可了 468家公司，兩所大學(xué)共獲得了許可費(fèi)收入約 美元。 2 重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備二、重組 DNA導(dǎo)入大腸桿菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞重組體的轉(zhuǎn)化重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞受體細(xì)胞重組體的轉(zhuǎn)化重組體的轉(zhuǎn)化 由流動鑲嵌模型發(fā)展而來的生物膜結(jié)構(gòu)模型 黑膜試驗(yàn)不同分子通過無膜蛋白的人工脂雙層1. 目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。一、感受態(tài)大腸桿菌的制備 原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化）原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化）1)受體細(xì)胞的選擇受體細(xì)胞的選擇限制缺陷型限制缺陷型 : 避免修飾和降解避免修飾和降解重組缺陷型：重組缺陷型： 避免重組整合避免重組整合轉(zhuǎn)化親和型：轉(zhuǎn)化親和型： 較高的可轉(zhuǎn)化性較高的可轉(zhuǎn)化性遺傳互補(bǔ)型：遺傳互補(bǔ)型： 利于篩選利于篩選感染缺陷型：感染缺陷型： 防止感染防止感染實(shí)驗(yàn)中使用的受體細(xì)胞為大腸桿菌實(shí)驗(yàn)中使用的受體細(xì)胞為大腸桿菌 DH5 alpha菌株。菌株。使用喪失了 限制體系 的大腸桿菌。如 K12系列的大腸桿菌。2. 菌種用 CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3. 制備原理CaCl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化特殊處理特殊處理受體細(xì)胞受體細(xì)胞細(xì)胞膜特性細(xì)胞膜特性改變改變CaCl2處理處理受體細(xì)菌受體細(xì)菌50100mmol/LCaCl2 感受態(tài)感受態(tài)細(xì)菌細(xì)菌重組體轉(zhuǎn)重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌入細(xì)菌4. 制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至On ice 510 min4℃ 離心3000g 10min收集菌用冰冷的50mMCaCl2重懸4℃ 離心收集菌4℃ 離心收集菌分裝、 70 ℃凍存用冰冷的50mMCaCl2重懸On ice 30 min用冰冷的50mMCaCl2重懸（ 15%甘油）3離心 3重懸 2冰浴CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞流程１．將宿主菌在瓊脂
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