基因的體外重組和轉(zhuǎn)化-文庫吧在線文庫
【正文】 、 PCR產(chǎn)物的連接四、體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)五、體外連接的結(jié)果體外連接DNA連接酶 ： 由大腸桿菌基因組 DNA編碼，以NAD+作為能源輔助因子。ＤＮＡ連接酶一、粘性末端的連接利用粘性末端 單鏈間 的堿基互 補(bǔ) ，并用DNA連接酶把相互靠近的 5’端磷酸 與 3’OH連到一起。（ 2）銜接物 (linker)連接① linker用化學(xué)合成法合成的一段 1012bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的 平端雙鏈 。 （以后再用 T4多核苷酸激酶 加上磷酸。大多數(shù)連接反應(yīng)用 T4DNA連接酶，但大腸桿菌的 DNA連接酶可用于粘性末端的連接，平末端連接時(shí)用此酶，活力較低。2. DNA插入的方向正確（ 1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。 2 重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備二、重組 DNA導(dǎo)入大腸桿菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞重組體的轉(zhuǎn)化重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞受體細(xì)胞重組體的轉(zhuǎn)化重組體的轉(zhuǎn)化 由流動鑲嵌模型發(fā)展而來的生物膜結(jié)構(gòu)模型 黑膜試驗(yàn)不同分子通過無膜蛋白的人工脂雙層1. 目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。３．從中吸取 1ml轉(zhuǎn)入 50ml LB培養(yǎng)基中 37℃ 振蕩培養(yǎng)， 測 OD600達(dá) ～。二、重組 DNA導(dǎo)入大腸桿菌（ 1）轉(zhuǎn)化（ transformation)大腸桿菌捕獲 質(zhì)粒 DNA的過程。C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成 50300?L 電轉(zhuǎn)儀調(diào)為,25?F 脈沖控制器200400? ?g質(zhì)粒DNA On ice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37176。3 重組 ?噬菌體 DNA的體外包裝與轉(zhuǎn)導(dǎo)cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后， 在 32℃ 下培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)能夠保持溶源性。（每 ?g ?DNA能形成 106噬菌斑）。 N(2羥乙基 )哌嗪 N39。4. DEAE葡萄糖傳染法葡聚糖葡聚糖 +DNA吸附到細(xì)胞表面后被細(xì)胞吞入，部分 DNA可以進(jìn)入到細(xì)胞核里。（ 2）特點(diǎn)：脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如 Life Technologies）。 轉(zhuǎn)化n 原生質(zhì)球 (Spheroplast) 指 細(xì)胞壁 未被全部去掉的細(xì)菌細(xì)胞，它呈圓球狀，可以人為地通過溶菌酶或青霉素處理革蘭氏陰性細(xì)菌而獲得。cI857 其它基因溶源狀態(tài)（ ?DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）?DNA阻遏 蛋白阻遏 蛋白44℃ —45 ℃?DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32℃?噬菌體 1 外殼蛋白基因 E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（ 尾部蛋白 ）。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。 3. 轉(zhuǎn)化方法 2. 轉(zhuǎn)化率簡單 ，但轉(zhuǎn)化效率不高（ 1）熱休克法（ heat shock）轉(zhuǎn)化效率高（ 2）電轉(zhuǎn)化法10ng載體 DNA100?L感受態(tài)菌 On ice混合，靜置10分鐘42186。７． 5000rpm 4℃ 離心 10分鐘，棄上清，加 100ul CaCl2重懸，置冰浴備用或于 4℃ 短期保存。如 K12系列的大腸桿菌。但可以與插入片斷以單鏈連接。引物 1GCAGAATTC 互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’ 3’ GCAGAATTC 互補(bǔ)序列5’ 3’ 3’ 模板GCAGAATTC 互補(bǔ)序列 PCR產(chǎn)物5’ 3’ 3’ 復(fù)性延伸模板模板3’ 3’ GCTAGCCGG 互補(bǔ)序列模板BamH I 位點(diǎn)5’ 3’ 5’ 復(fù)性延伸模板模板3’ 3’ GCTAGCCGG 互補(bǔ)序列 5’ 3’模板5’ GCTAGCCGG PCR產(chǎn)物 互補(bǔ)序列 5’ 3’引物 2帶酶切位點(diǎn)的 PCR產(chǎn)物GCAGAATTC PCR產(chǎn)物5’ 3’ GCTAGCCGG PCR產(chǎn)物 5’ 3’ CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn) BamHI位點(diǎn)AATTC PCR產(chǎn)物5’ 3’ GCTAG PCR產(chǎn)物 5’ 3’GCEcoRI BamHI兩頭各有一個(gè)粘性末端！2. 與 T載體直接連接（ 1） PCR產(chǎn)物兩個(gè) 3’端一般都有一個(gè) ATaq DNA聚合酶的特性：在 DNA雙鏈的 3’端再加上一個(gè)多余的核苷酸（優(yōu)先加 A）。連接體系載體 DNA
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