7重組體克隆的篩選和鑒定-資料下載頁(yè)
2025-02-12 13:28本頁(yè)面
【正文】 ， dNTP合成受阻 時(shí)， 胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補(bǔ)救 : DHFR細(xì)胞株（不能在 無(wú)核苷酸 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)）。 ① 宿主細(xì)胞 （ 2）選擇過(guò)程 透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補(bǔ)救。 ② 無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基 需要 胸腺嘧啶和次黃嘌呤 補(bǔ)救！ ③ 氨甲喋呤 “ 加壓 ” 添加少量氨甲喋啉抑制 內(nèi)源性 DHFR的補(bǔ)救作用，可提高選擇。 DHFR+基因。 ④ 載體標(biāo)記 只有轉(zhuǎn)入 DHFR+基因的細(xì)胞才能生存。 DHFR DHFR DHFR+ DHFR+ live die 無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基 是細(xì)菌抗生素，干擾細(xì)菌的核糖體，使細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進(jìn)行，但 不影響真核生物 。 3. 新霉素抗性基因（ neor） （ 1）選擇原理 ① 新霉素（ neomycin） 新霉素的類似物，是一種 氨基糖苷，對(duì) 真核細(xì)胞和原核細(xì)胞都有毒性 。 ② G418（ geicin） ③ 新霉素抗性基因 neor 細(xì)菌的新霉素抗性基因（ neor）編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶（ APH） ，能使 G418失活。 G418 真核細(xì)胞 死亡 G418 存活 neor 真核細(xì)胞 含 致死劑量 G418的完全培養(yǎng)基。 ① G418培養(yǎng)基 真核細(xì)胞株均可。 neor基因。 ② 宿主細(xì)胞 ③ 載體標(biāo)記 （ 2）選擇過(guò)程 G418：（ 100800?g/mL） CAT是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子 Tn9編碼的，催化氯霉素發(fā)生乙?；?失活。 氯霉素 cat 含氯霉素的完全培養(yǎng)基。 真核細(xì)胞株均可。 cat基因。 乙酰氯霉素 4. 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（ CAT） （ 1）選擇原理 （ 2） 選擇條件 （ 3） 宿主細(xì)胞 （ 4）載體標(biāo)記 chloramphenicol acetyl transferase 在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞提取物中測(cè)定是否有乙酰氯霉素。 （ 5） CAT分析方法 ② 免疫學(xué)檢查： 用抗 CAT的血清進(jìn)行 Western blot或ELISA，檢查 CAT的表達(dá)。 AntiCAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes. ① 分析乙酰氯霉素 二、植物轉(zhuǎn)化體報(bào)道基因篩選法 （ 1） 大腸桿菌的 βD葡萄糖醛酸糖苷酶 （ βDglucuronidase， GUS）； （ 2） 細(xì)菌和螢火蟲(chóng)的熒光素酶 （ luciferase）； （ 3） 水母綠色熒光蛋白（ GFP）基因 （ Green Fluorescent Protein）。 1. 報(bào)道基因（ reporter gene) （ 4）其它 2. 幾種報(bào)道基因的作用原理 4甲 βD葡糖醛酸 熒光產(chǎn)物 GUS GFP 紫外光照 發(fā)綠色熒光 5溴 4氯 3吲哚 βD葡糖醛酸 藍(lán)色水解產(chǎn)物 GUS Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 轉(zhuǎn)入螢火蟲(chóng)的 luciferase的煙草 煙草葉片表達(dá) B型肝炎抗原 βD葡萄糖苷酶 隱性 成熟 鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 顯性 成熟 螢火蟲(chóng)熒光素酶 隱性 成熟 細(xì)菌熒光素酶 隱性 成熟 蘇氨酸脫氫酶 顯性 成熟 磷酸肌醇乙酰轉(zhuǎn)移酶 顯性 成熟 乙酰乳酸合酶 顯性 不成熟 綠色熒光蛋白 顯性 成熟 Bromoxynil 硝化酶 顯性 不成熟 5enolpyruvylshikimate3磷酸轉(zhuǎn)移酶 顯性 成熟 演講完畢，謝謝觀看！
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