【正文】 neor基因。 ② 宿主細(xì)胞 ③ 載體標(biāo)記 （ 2） TK選擇過程 含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷 的培養(yǎng)基。 5）用 HRPO的底物浸泡膜。 Western Blot采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。 2. 方法 對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。 只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。 DHFR 載體 連接 轉(zhuǎn)化受體菌 三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板 含 DHFR的克隆才能生長(zhǎng) 例： 使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。 第一節(jié) 載體表型選擇法 1. 原理： pBR322 （ 1）四環(huán)素 ： （ 2）氨芐青霉素抗性基因： 2. pBR322抗菌素標(biāo)記選擇 產(chǎn)生 ?內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（ I2KIAampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。 載體和受體菌基因組可以 互補(bǔ) 形成完整有功能的 ?半乳糖苷酶。 （ 4）檢查是否有 PCR產(chǎn)物。 利用抗體作為 “ 探針 ” 來檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。 （ 3）二抗結(jié)合 二抗 加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。 1）直接染色 直接染色電泳結(jié)果 （ 2） Western blotting 電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、 PVDF膜、中性尼龍膜等）。 2. 過程 硝酸纖 維素濾膜 載體和插 入的 cDNA 總 mRNA cDNA基因的 mRNA 雜交 洗脫 cDNA基因的 mRNA 體外翻譯 cDNA編碼的蛋白 電泳 凝膠放射自顯影 cDNA編 碼的蛋白 硝酸纖 維素濾膜 載體和插 入的 cDNA 硝酸纖 維素濾膜 載體和插 入的 cDNA 收集 35S標(biāo)記的氨基酸 專門設(shè)計(jì)檢測(cè)能同 DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。 DHFR+基因。 AntiCAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes. ① 分析乙酰氯霉素 二、植物轉(zhuǎn)化體報(bào)道基因篩選法 （ 1） 大腸桿菌的 βD葡萄糖醛酸糖苷酶 （ βDglucuronidase， GUS）； （ 2） 細(xì)菌和螢火蟲的熒光素酶 （ luciferase）； （ 3） 水母綠色熒光蛋白（ GFP）基因 （ Green Fluorescent Protein）。 ① 宿主細(xì)胞 （ 2）選擇過程 透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補(bǔ)救。 單鏈 mRNA 核糖體 小亞基 核糖體 大亞基 能翻譯 mRNA DNA 核糖體 小亞基 核糖體 大亞基 不能翻譯 1. 原理 2. 過程 四、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法 1. 原理： 在高甲酰胺溶液中載體上克隆的 cDNA與它的 mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對(duì)應(yīng)的 mRNA，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。 硝酸銀： 靈敏度高、可檢出 25ng/帶。二抗只識(shí)別一抗。 主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。 （ 2）用外源 DNA插入片斷引物作 PCR。 受體菌基因組 中有突變的 ?半乳糖苷酶基因（ ?片段缺失）。 殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。 一、直接電泳檢測(cè)法 從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。 （ 2） R環(huán)檢測(cè)法