7重組體克隆的篩選和鑒定(更新版)
【正文】 專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)檢測(cè)能同 DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。 6）暗室里曝光，沖洗膠片。 1）直接染色 直接染色電泳結(jié)果 （ 2） Western blotting 電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、 PVDF膜、中性尼龍膜等）。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。 （ 3）二抗結(jié)合 二抗 加入無(wú)色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。 三、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ ELISA） Enzymelinked immunosorbant assay 1. 原理： 一抗（ primary antibody） : 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。 利用抗體作為 “ 探針 ” 來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。 酶切前 酶切后 插入片斷 載體 Southern blot 篩選結(jié)果 （ 1）原位雜交篩選 特點(diǎn)： 對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。 （ 4）檢查是否有 PCR產(chǎn)物。 2. 增加新性狀 利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。 載體和受體菌基因組可以 互補(bǔ) 形成完整有功能的 ?半乳糖苷酶。 抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。 第一節(jié) 載體表型選擇法 1. 原理： pBR322 （ 1）四環(huán)素 ： （ 2）氨芐青霉素抗性基因： 2. pBR322抗菌素標(biāo)記選擇 產(chǎn)生 ?內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（ I2KIAampicillin）（藍(lán)灰色）褪色?？梢员?IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 DHFR 載體 連接 轉(zhuǎn)化受體菌 三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板 含 DHFR的克隆才能生長(zhǎng) 例： 使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。 （ 3）電泳 PCR產(chǎn)物。 只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。 從宿主細(xì)胞中提取 RNA，再用探針雜交。 2. 方法 對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。 二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、脲酶等）。 Western Blot采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。 2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。 5）用 HRPO的底物浸泡膜。 研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。 ② 宿主細(xì)胞 ③ 載體標(biāo)記 （ 2） TK選擇過(guò)程 含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷 的培養(yǎng)基。 ② 無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基 需要 胸腺嘧啶和次黃嘌呤 補(bǔ)救！ ③ 氨甲喋呤 “ 加壓 ” 添加少量氨甲喋啉抑制 內(nèi)源性 DHFR的補(bǔ)救作用，可提高選擇。 neor基因。 1. 報(bào)道基因（ reporter gene) （ 4）其它 2. 幾種報(bào)道基因的作用原理 4甲 βD葡糖醛酸 熒光產(chǎn)物 GUS GFP 紫外光照 發(fā)綠色熒光 5溴 4氯 3吲哚 βD葡糖醛酸 藍(lán)色水解產(chǎn)物 GUS Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 轉(zhuǎn)入螢火蟲(chóng)的 luciferase的煙草 煙草葉片表達(dá) B型肝炎抗原 βD葡萄糖苷酶 隱性 成熟 鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 顯性 成熟 螢火蟲(chóng)熒光素酶 隱性 成熟 細(xì)菌熒光素酶 隱性 成熟 蘇氨酸脫氫酶 顯性 成熟 磷酸肌醇乙酰轉(zhuǎn)移酶 顯性 成熟 乙酰乳酸合酶 顯性 不成熟 綠色熒光蛋白 顯性 成熟 Bromoxynil 硝化酶 顯性 不成熟 5enolpyruvylshikimate3磷酸轉(zhuǎn)移酶 顯性 成熟 演講完畢，謝謝觀看！
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