基因工程第四章目的基因的分離和合成-資料下載頁
2025-09-11 20:46本頁面
【正文】 葉亞新 優(yōu)點：不依賴于基因表達產(chǎn)物的生物學活性 ,只要抗原決定序列能被正確表達。 * 外源 DNA可以是一個完整編碼區(qū)，也可能是一個外顯子，這些序列可以插入。 必備條件：待分離基因的表達產(chǎn)物 — 蛋白質(zhì)必須純化和用于制備相應抗體。 2) 分離步驟 基因文庫 → 蛋白質(zhì)樣品膜制備 → 免疫法篩選 → 有色斑點（陽性克隆） → 進一步證實：分離陽性克隆無細胞抽提物，作斑點印跡， western印跡免疫分析；分離重組 DNA，檢測插入片段大小，測序等。 2022/9/20 蘇州科技學院生物系 葉亞新 目的基因的分離 2. 目的基因的序列克隆法 1) 根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因 ? 用核酸探針進行雜交篩選：根據(jù)已知序列合成相應探針，再與基因組文庫的克隆進行雜交，篩選陽性克隆，最后分離鑒定 2) 表達序列標簽（ EST）法分離目的基因 ? 表達序列標簽（ expressed sequence tag EST） :是指基因序列中一段能特異地標記或表征基因的序列。 2022/9/20 蘇州科技學院生物系 葉亞新 篩選目的基因片斷的差別雜交及減法雜交技術(shù) 1. 差別雜交（ differential hybridization）法 應用前提 ：需要擁有兩種不同的細胞群，即在一個細胞群中目的基因能正常生長，而在另一細胞群中目的基因不表達。 Fig421 2. 減法雜交（ subtractive hybridization）技術(shù) ? mRNA減法雜交 fig422 ? 基因組 DNA減法雜交 fig423 2022/9/20 蘇州科技學院生物系 葉亞新 利用差示分析法分離目的基因克隆 1. mRNA差別顯示技術(shù)（ DDPCR,DDRTPCR） fig 424 2. 抑制性減法雜交（ SSH）技術(shù) ? 該法是一種用于分離和鑒定差異表達基因的革命性方法，特別適宜于那些差異表達量很低的基因，其富集效率在 1000倍以上。 待測 dscDNA（ tester cDNA）和驅(qū)動 dscDNA（ driver cDNA） fig 426 2022/9/20 蘇州科技學院生物系 葉亞新 4. 染色體巡查法 (chromosome walking) 1) 原理 利用 DNA探針篩選對應重組 DNA，然后以插入片段兩末端片段為探針選擇對應重組 DNA，此次篩選的 DNA插入片段僅以一端為探針，繼續(xù)和重復該過程，直至篩選到目的基因 優(yōu)點：可獲得染色體中一段 DNA的限制酶圖譜，對基因組全序 列測定十分有用 缺點：工作量大，鑒定困難，當巡查高等真核生物染色體時，重復 DNA序列區(qū)域難以跨越。 必要條件：兩基因間距離應清楚。 * 該法的兩大難點：限制酶圖制作和末端片段探針制備。前者可用改進的載體，后者可用 RNA聚合酶合成末端探針 2) 操作步驟 2022/9/20 蘇州科技學院生物系 葉亞新 5. 蛋白質(zhì) DNA雜交法 1) 原理 利用某些基因產(chǎn)物可與 DNA分子上特異序列結(jié)合的特點分離那些參與基因表達調(diào)控的基因 DNA探針可以是調(diào)控蛋白結(jié)合的序列，其長度盡可能短且能獲得雜交斑點。小于 150bp的 DNA探針可大大降低非特異性結(jié)合。 DNA探針必須是雙鏈，否則會導致大量的非特異性結(jié)合。 必要條件： 目的基因或 cDNA必須在宿主細胞中表達 2) 操作步驟 基因文庫 → 制備蛋白質(zhì)樣品膜 → 與標記 DNA探針 → 陽性克隆 → 序列測定 → 基因表達 → 蛋白質(zhì) DNA結(jié)合實驗 → 特異性 DNA序列分析和進一步確證實驗（足跡分析技術(shù)等） 2022/9/20 蘇州科技學院生物系 葉亞新 6. 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)結(jié)合法 酵母雙雜交法 1) 原理 利用釀酒酵母的 GAL4蛋白質(zhì) N端和 C端分別融合的兩種蛋白質(zhì)相互作用可激活具有 UAS（ upstream activating sequence，上游激活序列）報告基因表達篩選目的基因的方法。 i. GAL4蛋白質(zhì)是一個調(diào)控基因，控制半乳糖利用酶類基因的表達，這些基因的 5’ 端存在 UAS序列； ii. GAL4存在兩個結(jié)構(gòu)域： N端 (1147)具有 UASDNA結(jié)合域 (DNAbinding domain, BD), C端 (768881)具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 (transcriptional activation domain, AD)。這兩個結(jié)構(gòu)域可以單獨起作用。 2022/9/20 蘇州科技學院生物系 葉亞新 iii. 如果 AD和 BD分別與兩個基因編碼序列融合，且兩種蛋白質(zhì)能相互發(fā)生結(jié)合，就可導致 GAL1LacZ基因的表達。其中與 BD融合的基因稱之為釣餌基因 ，與 AD融合的基因可稱之為 目的基因 (即建立的基因文庫 )。 為了提高報告基因的表達活性， LacZ基因還可以與 HIS3基因融合在一起，只有當 HIS3基因表達量足夠大時，轉(zhuǎn)化細胞才能在合成培養(yǎng)基上生長。 2) 操作步驟 構(gòu)建釣餌融合基因（ BD） 轉(zhuǎn)化相應的酵母菌株 在檢測平板上篩選 構(gòu)建文庫（ AD） 陽性菌落 提取質(zhì)粒 DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 陽性克隆的進一步鑒定
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