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2024-12-28 05:12本頁面
【正文】 割酶處理，形成平均長度 256bp的代表群（ representation）保證絕大部分遺傳信息能被擴增。每次 T減 D反應后僅設置 72℃ 復性與延伸，94℃ 復性這兩個參數(shù)共 20個 PCR循環(huán)， PCR產物的特異性和所得探針的純度非常高。 ? Twohybrid system也叫 interaction trap（相互作用陷井），是 90年代初發(fā)展起來的分離基因的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質（ target protein）相互作用的基因。 ? 基本原理： 真核生物的轉錄因子大多是由兩個結構上分開、功能上獨立的結構域組成的。如 GAL4的 N端 1147aa是 DNA結合域（ BD），其 C端 768881aa是轉錄激活域（ AD）。一般情況下， AD能與 GAL4效應基因啟動子上游的特定 DNA區(qū)段（ UAS）相結合，而此時， AD則推動了轉錄起始。 ? 若用基因工程的方法，將 GAL4 AD和 BD分別克隆到不同的載體上，導入同一細胞株中表達，效應基因無法被激活 ,但可把來自不同轉錄因子的 AD或 BD區(qū)域連成一個功能基 ? 主要實驗過程： a. 選擇缺失 GAL4編碼基因的酵母寄主菌株 SFY526或 HF7c； b. 構建帶有 GAL1 UAS啟動子 lac Z（ His3）的轉化載體 。 c. 把已知的靶蛋白質編碼基因克隆到 pGBT9的多克隆位點上，把所有 cDNA都克隆到 pGAD424載體上，構成 cDNA表達文庫。 d. 從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質粒 DNA，共轉化感受態(tài)釀酒酵母菌株。 e. 將共轉化的酵母菌株涂布于缺少 Leu， Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達相互作用的雜種蛋白的陽性菌落。 ? Mapbased cloning是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說，所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過該方法克隆得到。首先，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側確定緊密連鎖的 RFLP或 RAPD分子標記。二、利用與目的基因最緊密連鎖的一對分子標記作探針，通過染色體步移技術將位于這兩個標記之間的基因片段克隆并分離出來。三、根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。 ? 通過對許多不同的生態(tài)型及大量限制性內切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標記。在 RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來計算的， 1cm（厘米）相當于 1%的重組率。人類基因組中， 1cm≈1000kb。擬南芥菜中，1cm≈290kb。小麥中， 1cm≈3500kb。 四、 DNA的 Microarray 只要事先除去高度及中等重復序列，任何 DNA都可以被用于Microarray。最簡單的例子是用機械手把極微量（ nanoliters）的 DNA點到玻片或其它載體上，照射 UV light使之永久固定，用不同細胞周期發(fā)育階段的 cDNA作探針系統(tǒng)性地研究細胞中任意時期特異表達的基因；若把某一生物體內全部全部已知基因分別點到 DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發(fā)育階段的 cDNA與之雜交，就能了解某些基因對特定生長發(fā)育階段的重要性；基因芯片還可用于進行基因診斷，可建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標準雜交信號圖。用可疑病人的 cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達受抑制或激活。 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAIT
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