分子生物學(xué)研究法-食品伙伴網(wǎng)原食品伴侶網(wǎng)關(guān)注食品安全，-資料下載頁
2024-12-28 05:12本頁面
【正文】 割酶處理，形成平均長度 256bp的代表群（ representation）保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次 T減 D反應(yīng)后僅設(shè)置 72℃ 復(fù)性與延伸，94℃ 復(fù)性這兩個參數(shù)共 20個 PCR循環(huán)， PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。 ? Twohybrid system也叫 interaction trap（相互作用陷井），是 90年代初發(fā)展起來的分離基因的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)（ target protein）相互作用的基因。 ? 基本原理： 真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨立的結(jié)構(gòu)域組成的。如 GAL4的 N端 1147aa是 DNA結(jié)合域（ BD），其 C端 768881aa是轉(zhuǎn)錄激活域（ AD）。一般情況下， AD能與 GAL4效應(yīng)基因啟動子上游的特定 DNA區(qū)段（ UAS）相結(jié)合，而此時， AD則推動了轉(zhuǎn)錄起始。 ? 若用基因工程的方法，將 GAL4 AD和 BD分別克隆到不同的載體上，導(dǎo)入同一細(xì)胞株中表達(dá)，效應(yīng)基因無法被激活 ,但可把來自不同轉(zhuǎn)錄因子的 AD或 BD區(qū)域連成一個功能基 ? 主要實驗過程： a. 選擇缺失 GAL4編碼基因的酵母寄主菌株 SFY526或 HF7c； b. 構(gòu)建帶有 GAL1 UAS啟動子 lac Z（ His3）的轉(zhuǎn)化載體 。 c. 把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到 pGBT9的多克隆位點上，把所有 cDNA都克隆到 pGAD424載體上，構(gòu)成 cDNA表達(dá)文庫。 d. 從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質(zhì)粒 DNA，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母菌株。 e. 將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少 Leu， Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種蛋白的陽性菌落。 ? Mapbased cloning是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說，所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過該方法克隆得到。首先，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的 RFLP或 RAPD分子標(biāo)記。二、利用與目的基因最緊密連鎖的一對分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來。三、根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。 ? 通過對許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記。在 RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來計算的， 1cm（厘米）相當(dāng)于 1%的重組率。人類基因組中， 1cm≈1000kb。擬南芥菜中，1cm≈290kb。小麥中， 1cm≈3500kb。 四、 DNA的 Microarray 只要事先除去高度及中等重復(fù)序列，任何 DNA都可以被用于Microarray。最簡單的例子是用機(jī)械手把極微量（ nanoliters）的 DNA點到玻片或其它載體上，照射 UV light使之永久固定，用不同細(xì)胞周期發(fā)育階段的 cDNA作探針系統(tǒng)性地研究細(xì)胞中任意時期特異表達(dá)的基因；若把某一生物體內(nèi)全部全部已知基因分別點到 DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發(fā)育階段的 cDNA與之雜交，就能了解某些基因?qū)μ囟ㄉL發(fā)育階段的重要性；基因芯片還可用于進(jìn)行基因診斷，可建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號圖。用可疑病人的 cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAIT
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