【正文】 法是自我連接法（ SelfLigation method） 反轉(zhuǎn)錄（ RT）反應(yīng) Hybrid RNA的分解 單鏈 cDNA的自身連接 PCR擴增 5‘未知區(qū)域 目的 DNA片段的切割回收 DNA序列測定 5. 5. 2 cDNA差示分析法 (RDA, Representation Difference Analysis) 充分發(fā)揮了 PCR能以指數(shù)形式擴增雙鏈 DNA模板 ， 而僅以線性形式擴增單鏈模板的特性 ， 通過降低 cDNA群體復雜性和更換 cDNA兩端接頭等方法 ， 特異性擴增目的基因片段 。PCR產(chǎn)物的特異性和所得的 cDNA片段純度均高 。 因為 Tester和 Driver在接受差示分析前均經(jīng)一個 4堿基切割酶處理 ， 形成平均長度 256bp的代表群 ， 保證絕大部分遺傳信息能被擴增 。 5. 5. 3 Gateway大規(guī)模克隆技術(shù) Gateway技術(shù)利用 λ噬菌體進行位點特異性DNA片段重組 ， 實現(xiàn)了不需要傳統(tǒng)的酶切聯(lián)接過程的基因快速克隆和載體間平行轉(zhuǎn)移 。 Gateway大規(guī)?？寺〔呗? TOPO反應(yīng) : 將目的基因 PCR產(chǎn)物連入 Entry載體 。 載體上的 CCCTT被拓撲異構(gòu)酶所識別 ， 通過與切口處的磷酸基團形成共價鍵 ， 將該酶偶聯(lián)在載體上 。 5’GTGG粘性末端攻擊 PCR產(chǎn)物的互補性末端并與接頭序列 CACC退火 ， 使PCR產(chǎn)物以正確方向連入 Entry載體 。 （ 見圖 524a P186） LR反應(yīng)： 將目的片段從 Entry 載體中重組入表達載體 。Entry載體上基因兩端具有 attL1和 attL2位點 ，目的載體上含有 attR1和 attR2位點 ， 在重組蛋白的作用下發(fā)生定向重組 ， 形成新的位點 attB1和 attB2， 將目的基因轉(zhuǎn)移到表達載體中 。 （ 見圖 524b P186） 5. 5. 4 基因的圖位克隆法 （ Mapbased cloning） 所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過該方法克隆得到 。 通過構(gòu)建遺傳連鎖圖 ， 將目的基因定位到某個染色體的特定位點 ， 并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的 RFLP或 RAPD分子標記 。 通過對不同的生態(tài)型及限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析 ， 找出與目的基因距離最近的分子標記 ， 通過染色體步移法將位于這兩個標記之間的基因片段克隆并分離出來 ， 根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因 。 染色體步移法克隆基因示意圖 在 RFLP作圖中 ， 連鎖距離是根據(jù)重組率來計算的 ， 1cM（ 厘摩 ） 相當于 1%的重組率 。人類基因組中 ， 1cM≈1000kb；擬南芥菜中 ，1cM≈290kb；小麥中 ， 1cM≈3500kb。 用圖位克隆法獲得水稻脆桿基因 BC1 BCl定位于水稻 3號染色體 （ Chr3） 分子標記 C524a和 RM16之間； B. 覆蓋 BCl位點的 BAC大片段 。 C. BCl位點的精細定位 。 BCl位點被定位于分子標記 P2和 P4之間與 P3共分離 。 D. BCl基因結(jié)構(gòu) 。 紅色為編碼區(qū) ， 白色為 5’和 3’非翻譯區(qū) ， 黑色線段為內(nèi)含子 。 bcl1和 bcl2表示兩個突變位點 。 Li, Y., Qian, Q., Zhou, Y., Yan, M., Sun, L., Zhang, M., Fu, Z., Wang, Y., Han, B., Pang, X., Chen, M., and Li, J. (2022). BRITTLE CULM1, which encodes a COBRAlike protein, affects the mechanical properties of rice plants. Plant Cell 15, 2020–2031. 5. 6 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學技術(shù) 蛋白質(zhì)組學是蛋白質(zhì) （ protein） 和基因組（ genome） 研究在形式和內(nèi)容兩方面的組合 ， 該技術(shù)致力于研究某一物種 、 個體 、 器官 、 組織或細胞在特定條件 、 特定時間所表達的全部蛋白質(zhì)圖譜 。 蛋白質(zhì)組與基因組既相互對應(yīng)又有顯著不同 ，基因組是確定的 ， 每個個體只有一個基因組 ，而基因的表達調(diào)控水平 （ 蛋白組 ） 卻會發(fā)生顯著的變化 。 由于蛋白質(zhì)分離 （ 雙向電泳和高效液相層析技術(shù) ） 和鑒定技術(shù) （ 現(xiàn)代質(zhì)譜 ） 的進步 ， 以及基因組學和生物信息學的交叉滲透 ， 蛋白質(zhì)組學研究在已經(jīng)獲得了長足的發(fā)展 。 雙 向 電 泳 （ Two － Dimensional Electrophoresis， 2D） 技術(shù) 等電聚焦 （ Isoelectric focusing， IEF） 及 SDS聚丙烯酰胺凝膠 （ SDSPAGE） 雙向電泳技術(shù) 。蛋白質(zhì)是兩性分子 ， 在不同 pH緩沖液中表現(xiàn)出不同的帶電性 ， 因此 ， 在兩性電解質(zhì)電泳體系中 ， 不同等電點的蛋白質(zhì)會聚集在介質(zhì)上不同的區(qū)域 （ 等電點 ） 從而被分離 。 蛋白質(zhì)的分子量決定了 SDS蛋白復合物在凝膠電泳中的遷移率 ， 因為聚丙烯酰胺凝膠中的 SDS帶有大量的負電荷 ， 與之相比 ， 蛋白質(zhì)所帶電荷量可忽略不計 。 因此 ， 蛋白質(zhì)在 SDS凝膠電場中的運動速度和距離完全取決于其分子量 。 2DE map of protein from Arabidopsis seeds 30h after germination 野生型和突變體棉花胚珠總蛋白質(zhì)樣品的雙向電泳圖譜比較 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù) 現(xiàn)行質(zhì)譜儀主要有三個連續(xù)的組成部分 ， 即離子源 ， 離子分離區(qū)和檢測器 。 較常用的有基質(zhì)輔助的激光解析電離 飛行時間質(zhì)譜（ MatrixAssisted Laser Desorption Ionization TimeOfFlight spectrometry， MALDITOF）和電噴霧質(zhì)譜（ Electrospray ionization， ESIMS）。 MALDITOF的工作原理：將蛋白質(zhì)酶解成小肽段后與基質(zhì) （ 主要是有機酸 ） 混合 ， 將樣品混合物點到金屬靶表面上并使之干燥結(jié)晶 ，然后用激光轟擊 ， 將呈離子化氣體狀態(tài)的待分析物從靶表面噴射出去 。 離子化氣體肽段在電場中被加速后到達檢測器的時間由肽段的質(zhì)量和其所帶電荷數(shù)的比值 （ m/z） 決定 。 MALDI–TOF分子質(zhì)譜儀原理圖 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗（ Western Blotting） 是檢測樣品中是否存在蛋白抗原的一種可靠方法。主要分為： a、蛋白樣品的制備； b、 SDSPAGE分離 。 c、轉(zhuǎn)膜載并封閉膜上未反應(yīng)位點，減少非特異性吸附； d、與相應(yīng)非標記抗體（一抗）反應(yīng)； e、洗去多余的一抗，加酶偶聯(lián)或放射性同位素標記的二抗，通過顯色或放射自顯影法檢測凝膠中的蛋白成分。 免疫印跡 （ Western Blotting）示意圖 .