【正文】 和塊莖還可以剖開或切成薄片，在切面上滴細菌懸浮液接種。植物病原細菌很少引起根腐 (塊根除外 )，但莖腐還是常見的。 ? [4]蔫萎病的接種 蔫萎病的接種可以采用針刺、注射、蘸或灌注土壤等方法接種，使細菌侵入到寄主維管束組織中。 第五節(jié) 細菌的形態(tài) ? 革蘭氏染色法 革蘭氏染色反應(yīng)是細菌分類和鑒定的重要性狀。它的機制還不完全了解 ? 一種解釋是堿性染料可以穿過細胞壁與細胞原生質(zhì)的酸性成分起作用，加碘以后形成復(fù)合體。革蘭氏反應(yīng)陽性的細菌，它的細胞壁阻止褪色劑對復(fù)合體中染料的提取，所以不褪色。革蘭氏反應(yīng)陰性的細菌，可能由于細胞壁中含有較多的類脂物，可以被褪色劑溶解，因而染料可被提取而褪色。 ? 還有一種解釋認為碘液是起染媒劑的作用，與結(jié)晶紫以及細胞中核糖核和鎂離子形成復(fù)合體，這種復(fù)合體不容易被褪色。革蘭氏染色反應(yīng)陰性的細菌不形成這的復(fù)合體，結(jié)晶紫就容易褪色除去。 ? 方法及其他注意事項 (略 ) 結(jié)果 : 陽性菌 —— 紫色 陰性菌 —— 紅色 結(jié)晶紫初染 碘液媒染 乙醇脫色 番紅復(fù)染 涂片固定 由丹麥醫(yī)生 Hans Christian Gram于 1884年 創(chuàng)立。 Figure 1 Gram + Figure 2 Gram 鞭毛染色 ? 植物病原細菌的染色，除去革蘭氏染色外，最重要的是鞭毛染色。鞭毛的有無、數(shù)目和著生部位是重要的分類和鑒定性狀。一種植物病原細菌，經(jīng)過革蘭氏染色和鞭毛染色，大致已經(jīng)可以確定它的屬。 ? 細菌的鞭毛很細 (只有 ～ )，一般光學(xué)顯微鏡看不清，鞭毛上沉積了染劑后才能看到，這是所有鞭毛染色法的根據(jù)。 ? 由于染劑也可以在載玻片上沉積，所以要用非常清潔的載玻片。染劑處理的時間很重要，處理時間太短，鞭毛上沒有足夠的沉積物就看不清楚；處理時間太長，載玻片上的沉積物太多則影響檢查。 (1)載玻片的準備 鞭毛染色要用新的或沒有損傷的載玻片，先在 濃鉻酸洗滌液中浸24h， 清水洗 過后用 蒸餾水洗 ，再在 95%的酒精中浸 過后，將玻片通 過火焰幾次 ，到載玻片邊緣的火焰呈桔黃色為止。通過火焰的載玻片，放在多層吸水紙上任其冷卻。洗凈的載玻片也可以浸在盛有 95%5酒精的扁平染色皿中，使用前再通過火焰燒去酒精， 檢驗是否潔凈的標準是在載玻片上加 1滴蒸餾水，如果水滴很快而且均勻地擴散開來，表示載玻片是清潔適用的。 (2)細菌懸浮液的配制 ? 配制細菌懸浮液時要注意菌齡，最好是用在斜面上培養(yǎng) 18～ 24h的 ，但生長較慢的 (如黃單胞桿菌屬 )細菌，可用適當延長到 3648h的。 ? 染色前，菌種每隔一二天移植一次，必要時可連續(xù)進行幾次，以增強細菌的活性。 配制的時候，在培養(yǎng)斜面上加滅菌水 35ml(可根據(jù)濃度增減 )靜置 (可以稍加搖動，但不要振動 )一定時間，細菌就散開而形成懸浮液。放置的時間一般是 530min，產(chǎn)生膠質(zhì)的細菌則需要 30min或更久一些。放置時間太長，細菌的鞭毛可能會脫落。染色前，可先用懸滴法觀察細菌是否運動。 (3)涂片 ? 涂片的方法是用微吸管或移植環(huán)取懸浮液 1滴或 2～ 3滴加在潔凈的載玻片上；立即將玻片直立，使菌液流下，玻片上即遺留一條或兩三條細菌懸浮液膜。最好是從懸浮液中活動的細菌較多的上層取樣。載玻片保持直立使菌液干燥，鞭毛染色的玻片都不通過火焰固定直接染色。 (4)染色 涂片 干燥 固定 染色 1min 水洗、吸干 鏡檢 制備涂片標本 → 染色 第六節(jié) 生理和生物化學(xué)性狀 ? 1．溫度的關(guān)系 ? 2．細菌的耐干能力 ? 3．細菌的耐鹽性 ? 4．好氧性和厭氧性 4．好氧性和厭氧性 ? 植物病原細菌都是需氧性的或兼性需氧性的。細菌生長與空氣的關(guān)系，可用 HL方法測定，培養(yǎng)基的成分是： ? 蛋白胨 2g 氯化鈉 (NaCl) 5g 磷酸氫二鉀 (K2HPO4) 瓊膠 3g 蒸餾水 1000ml 溴百里酚藍 (1％水溶液 ) 3ml 酸度調(diào)節(jié)到 。 ? 試管盛培養(yǎng)基的深度達 4～ 5cm，滅菌后加滅菌的葡萄糖 (1％ )。這種軟瓊膠培養(yǎng)基，從底部缺氧狀況逐漸過渡到頂部有氧狀況，可以用來觀察細菌生長與供氧的關(guān)系。 ? 接種的方法是當瓊膠柱凝固后，用針刺接種 (一直刺到管底 )培養(yǎng) 24h左右的細菌，或者將培養(yǎng)基冷卻到 39~40℃ 左右，滴入一定量的細菌液，充分混合后任其冷卻凝固。 ? 取兩管接菌的，上面加一層滅菌的石蠟油與凡士林等量混合物，深度約 lcm，用來隔絕空氣 (閉管 )，另外兩管接菌的則不加石蠟油和凡士林混合物 (開管 )。同時，分別用兩管不接菌也不加石蠟油和凡士林混合物和兩管不接菌而加石蠟油、凡士林混合物的作為對照。 ? 在適溫下培養(yǎng)，經(jīng)過 1d、 2d、 4d、 7d、 14d后觀察并記載結(jié)果。 ? 這種方法 主要用來區(qū)別一種細菌在含糖培養(yǎng)基上產(chǎn)生酸是由于氧化作用還是發(fā)酵作用，這是有些細菌的分類特征。 氧化產(chǎn)酸 (如葡萄糖的氧化為葡萄酸 )必須有分子氧的存在，因此氧化產(chǎn)酸只在開管的上部產(chǎn)酸，指示劑的顏色改變；發(fā)酵產(chǎn)酸則在開管和閉管中都可以產(chǎn)生酸。閉管的作用是減小氧化作用，使發(fā)酵作用更加清楚。如果還產(chǎn)生氣體，則在瓊膠柱內(nèi)可以看到氣泡。 5．碳素化合物的利用和分解 ? (1)發(fā)酵試驗 ? (2)檸檬酸鹽和丙二酸鹽的利用 ? (3)甲基紅試驗 6．氮素化合物的利用和分解 ? (1)硝酸鹽和亞硝酸鹽的還原 ? (2)蛋白胨的分解 氨的產(chǎn)生 硫化氫的產(chǎn)生 吲哚的產(chǎn)生